水稻籽实中cd、pb结合形态及其稳定性研究

水稻籽实中cd、pb结合形态及其稳定性研究

人们越来越关注食品中重金属的暴露。由于不同形式的重金属对动物和人类的毒性不同，从20世纪80年代以来，研究了食品中的重金属形式，如大豆、贝类、谷物等。我们还研究了水稻、小麦、谷物中cd、pb等有毒元素的存在形式。结果表明，粮食中的重金属主要与蛋白质结合。然而，由于水质变化、重金属提取物和酶消化的变化，环境条件恶化，重金属结合形式的稳定性。因此，研究食物中重金属的结合形式和稳定性对评估它们的毒性非常重要。谷物等食品是人类的主食,人体吃食,先要经过蒸煮,食物进入人体胃里后会受到各种消化酶的作用.在蒸煮和消化酶的作用下,食物中的蛋白质结构会发生改变,与蛋白质结合的重金属形态也会发生变化.本文拟通过模拟实验,探讨蒸煮和消化酶等环境条件对蛋白质-Cd、Pb结合形态稳定性的影响,为进一步评价谷物中重金属的毒性提供依据.1材料和方法1.1样本来源试验所选用的稻谷采自湖北省大冶铜矿区和云南兰坪县铅、锌矿山附近的污染农田.1.2样品的制备和测定稻谷去颖壳,研磨,然后脱去脂肪,风干后称取适量,用0.05mol/LTris-HCl(pH7.5)进行提取,样品与提取液之比为1∶10.将提取液样品置于冰箱内10h后,在20000g的高速冷冻离心机中离心1h,取上清液于冰冻干燥箱内浓缩5倍.取浓缩样品1mL用0.05mol/LTris-HCl溶解,经SephadexG75柱进行层析分离(2.0cm×100cm).用0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱.用自动部分收集器(BS2-100)以4mL/20min的流速,每管收集4mL洗脱液.紫外分光光度计(BECKMANDU-8B)测定洗脱液的紫外吸收峰(225nm处),并同步测定洗脱液中的Cd、Pb浓度.采用标准蛋白质曲线法测定洗脱液样品的分子量.标准蛋白质为:牛血清蛋白(分子量66000)、鸡卵清蛋白(分子量45000)、胰蛋白酶(分子量24000)、细胞色素C(分子量12400)、胰岛素(分子量5734),均为层析纯.将标准蛋白质混合液与样品相同的方法经SephadexG75柱层析,绘制蛋白质标准曲线.1.3蛋白质和凝胶层析分离准确称取一定量的被研磨的稻米置于烧杯中,加适量的去离子水,在电炉上加热,煮熟成米饭.然后,按步骤1.2的方法提取蛋白质和凝胶层析分离.1.4胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化实验1.4.1输注trs-hcl溶液胃蛋白酶溶液(16mg/L):称取胃蛋白酶160mg(Pepsin1:10000,SigmaP7000,539units/mg,华美生物工程公司),溶于10mL0.02mol/LTris-HCl溶液(pH7.0).胰蛋白酶溶液(30mg/L):称取胰蛋白酶300mg(Trypsin1∶250,LotNo.BE2185,华美生物工程公司),溶于10mL0.02mol/LTris-HCl溶液(pH7.0).1.4.2凝胶层析分离5mL冷冻干燥的水稻蛋白质提取液,分别溶于1mL胃蛋白酶溶液和1mL胰蛋白酶溶液,对照组分别加1mL无酶的0.02mol/LTris-HCl溶液,37℃恒温培养5h,然后按步骤1.2的方法凝胶层析过柱分离.1.5分析方法的确定将凝胶层析洗脱液样品经硝酸、高氯酸消化后用石墨炉原子吸收分光光度计(GBC906,澳大利亚)测定其含量.为了保证分析方法的准确性,采用了国家标准物质样品进行质量控制.2结果与讨论2.1糙米中cd、pb蛋白多肽的表观分子量脱脂水稻籽实样品用0.05mol/LTris-HCl缓冲液提取,并将提取液经SephadexG75柱进行凝胶层析,对洗脱液进行紫外吸收测定并同步进行Cd、Pb浓度分析,其结果示于图1.由图1看出,糙米的Tris-HCl可溶性组分经SephadexG75柱分离得到3个明显的紫外吸收峰,分别出现在洗脱液第15管(1峰)、31管(2峰)和44管(3峰)处.经与相同条件下的蛋白质曲线对照这3个峰的表观分子量分别为54.5KD、16.04KD和5.5KD.从洗脱液中Cd、Pb的浓度分布看,出现了2个明显的Cd、Pb峰,其出现位置恰与第1、3个紫外吸收峰相重合,第2紫外吸收处也有少量Cd、Pb分布.由此推断,糙米中Cd、Pb蛋白质(多肽)结合体的表观分子量为54.5KD和5.5KD.2.2cd、pb的浓度变化图2为蒸煮后的水稻籽实Tris-HCl提取液的凝胶层析结果.与对照比较(图1),蒸煮后的洗脱液中原有的3个蛋白质紫外峰的OD值都明显变小,特别第1峰下降明显,在第3峰后原来没有紫外吸收的地方也出现了紫外吸收.同时,洗脱液中Cd、Pb的浓度峰也有明显的变化,原来对照组中出现的2个明显的Cd、Pb浓度峰在蒸煮加热后不明显,在1到3峰之间的洗脱液中Cd、Pb的浓度都较低.而在第3峰之后新出现紫外吸收的洗脱液中检测到较高的Cd、Pb浓度.稻米经过蒸煮加热变成米饭,由于加热的作用会使稻米里的蛋白质发生热变性,使稻米中存在的天然蛋白质分子的二、三级以上的高级结构发生改变或破坏,通常蛋白质的共价键不会改变,即组成成分和分子量应该没有改变.图2中的结果有可能是蒸煮加热引起蛋白质的凝结,变成了不可溶物质,因此不能透过凝胶柱,使蛋白质1、2峰消失.也有可能一部分大分子的蛋白质-Cd、Pb结合体被破坏,或者分解变成蛋白质小分子或多肽,与蛋白质结合的Cd、Pb也被部分地释放出来.2.3洗脱液中cd和pb浓度的变化图3为水稻籽实蛋白质经胃蛋白酶消化后的凝胶层析结果.在胃蛋白酶的作用下,洗脱液的蛋白质紫外吸收峰发生了改变,第1个紫外吸收峰的OD值明显低于未加酶的对照组,而第2、3峰的OD值没有明显的变化.洗脱液中Cd、Pb的浓度分布也发生了改变,在第1、3峰处Cd的浓度明显降低,第1峰处Pb的浓度也明显降低,但第3峰处Pb的浓度变化不明显;另外,在第3峰之后的洗脱液中没有紫外吸收但可见Cd、Pb的浓度分布,可以推断是由第1峰蛋白质-重金属结合体分解所形成的,为一些小分子的肽类结合或游离的金属离子.从上述洗脱液的OD值和Cd、Pb浓度变化情况看,胃蛋白酶主要对分子量为54.5KD的蛋白质-Cd、Pb结合体(第1峰)发生作用.从第3峰处Cd的浓度下降,说明胃蛋白酶对分子量为5.5KD的蛋白质-Cd结合体有一定的影响,而对5.5KD的蛋白质-Pb结合体影响不大.2.4cd分布的变化水稻籽实蛋白质经胰蛋白酶消化后的凝胶层析结果见图4.在胰蛋白酶作用下,洗脱液的第1紫外吸收峰完全消失,第2、3峰的OD值与对照比较基本上没有改变.洗脱液第1、3峰处Cd、的浓度明显下降,第3峰之后的洗脱液中也有少量Cd的分布;洗脱液中Pb的分布与Cd有所不同,在第1峰处没有Pb的分布,在第2峰处Pb的浓度与对照差不多,第3峰处及之后的洗脱液中含有较高的Pb浓度.与上述胃蛋白酶消化结果比较,胰蛋白酶对分子量为54.5KD的蛋白质-Cd、Pb结合体分解得更彻底.对分子量为5.5KD的蛋白质-Cd结合体影响也比较大,而对蛋白质-Pb结合体的影响相对小些.这说明不同重金属元素和不同分子量蛋白质之间所形成的结合形态及其稳定性都存在一定的差异,其原因有待进一步研究.2.5半胱氨酸形态cd对大鼠肠道重金属含量的影响动物毒性实验表明,老鼠口服单一氯化镉的LD50为204.2mg/kg,而同时口服L-半胱氨酸(1500mg/kg)和氯化镉时的LD50为56.3mg/kg.另外,在半胱氨酸存在下口服氯化镉,增加老鼠器官中镉的积累量,这些说明不同形态的Cd对动物具有不同的毒性.动物及人体消化道内存在的胃蛋白酶主要水解芳香族或其它疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽键,胰蛋白酶只专一性地水解赖、精氨酸的羧基形成的肽键.根据本文的研究结果,水稻籽实中的Cd、Pb主要以蛋白质结合的形态存在,经过蒸煮和消化酶的作用后主要以小分子的结合形态存在,它们对动物和人体的毒性是增强或减弱,还缺乏毒理学实验数据,有待进一步研究证实.3对水稻籽实中蛋白质-cd、pb结合体的破坏通过凝胶层析方法对水稻籽实中的蛋白质-Cd、Pb结合体的分析,结果表明:水稻籽实中存在的蛋白质-Cd、Pb结合体的表观分子量分别为54.5KD和5.5KD.