植物重要农艺性状功能基因分离的研究

植物重要农艺性状功能基因分离的研究

近年来，现代生物科学技术的快速发展使其应用更加广泛。为了研究疾病、寿命等人们关注的基因以及人类基因组计划的实施完成不断开发出许多新技术,逐渐应用于动物上,继而应用到植物中。许多模式动植物的研究也积累了大量的信息和技术。基因分离一直是生物技术研究的一个中心,分离基因和分子辅助育种可以大大缩短育种进程,对指导生产实践具有特别重要的意义。分离基因的方法是在基因一个或几个特性基础上获得的。基因的特性可从中心法则中得到启示。依据基因的座位、转录和转译,基因的特性可以分为基因的序列(DNA),基因的转录产物——mRNA,基因的转译产物——蛋白质(protein),基因的功能和基因在基因组中的位置。根据这些特性将植物基因分离的方法分为以下几类,见表1。1基于生物活性的pcr扩增如果所要获得的基因在其它植物上已经分离,序列已知,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因:一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用RACE得到全长基因。二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库,获得研究植物里的基因。人类基因组计划的实施使大规模测序有了可能,相继各模式生物的测序工作也已经完成或展开。当各作物全基因组测序完成后,可以利用比较基因组学方法快速鉴定、分离感兴趣的基因。2pcr检测基因结果的表达高等真核生物约含有10万个基因,在一定的发育阶段、在某一类型的细胞中,只有15%的基因表达,产生大约15000个基因。这种在生物个体发育的不同阶段、或在不同的组织器官中发生的不同基因按一定时间和空间有序表达的方式称为基因的差别表达(differentialexpressing)。这是基因表达的特点,也是分离克隆目的基因的前提。基于基因表达特点的分离方法有如下几个:2.1差示筛选差示筛选又称差别筛选、示差筛选,是从检测样品(含有表达目的基因)和对照样品(不含有表达目的基因)里分别提取totalRNA,分离mRNA,经反转录制成cDNA探针。用含有表达目的基因的cDNA文库铺平板,每个平板连续转两套膜,要尽量保证两张膜的一致性。用两种探针各与一张膜杂交,放射自显影。比较两张X光片相同位置的杂交印斑,用对照样品cDNA作探针杂交的X光片中没有而在检测样品cDNA作探针杂交的X光片中有的印斑,可对照X光片从原平板挑出菌落进行鉴定是否含有目的基因。这种方法灵敏度低,对于高丰度的mRNA是一种有效方法,低丰度的mRNA则难以检测到。2.2扣除杂交1966年Bautz等基于差示筛选的局限性,提出扣除杂交,后又有多个实验室改进了这项技术。扣除杂交是从来源相似而功能有异的两种样品获得mRNA,含有目的基因的样品称为检测方(tester),不含有目的基因的样品称为驱动方(driver)。将检测方mRNA反转录为cDNA,与过量(10倍于检测方)的驱动方mRNA进行杂交,经过柱或其他方法去掉双链杂合体,富集目的基因,构建扣除cDNA文库,筛选目的基因。此法操作较难,重复性差,敏感度低。2.3mRNA差别显示1992年Peng等提出DDRT-PCR。根据真核生物3′端poly(A)尾的特点设计锚定引物T11MN12种,锚定引物可以将扩增产物分为12个亚组(M可为A、G、C三种碱基,N可为A、T、G、C四种碱基);另一端为10nt的随机引物20种(随机引物因序列不同而在离poly(A)最近的一端配对)。这些引物组合扩增后约能得到20000条带,可大致包括某一发育阶段的全部基因,扩增后利用测序胶分离,放射自显影或银染获得结果,并对差异片段回收、克隆、测序以确定其是否为目的基因。这种方法由于介入PCR技术,使低丰度mRNA的检测成为可能。但假阳性率高达70%,扩增条带分子长度较短,110~450bp。2.4代表性差示分析(RDA)1993年,Lisitsyn等在消减杂交基础上提出了RDA技术。Hubank等对方法进一步完善。该方法是用识别四核苷酸位点的限制性内切酶分别切割检测方(tester)和驱动方(driver)的DNA或cDNA,各连上接头Ⅰ,并以接头Ⅰ为引物分别进行PCR扩增。扩增后将接头Ⅰ切除,在检测方片段末端连接上接头Ⅱ。将检测方与过量的驱动方的DNA或cDNA混合杂交,退火时形成三种杂合体tester/tester、tester/driver、driver/driver。以接头Ⅱ为引物进行二次扩增,tester/tester都连有接头,与引物相配对,可以进行指数扩增;tester/driver只有tester有接头,可以进行线形扩增;而driver/driver没有接头,无法进行扩增,无扩增结果,这样就使tester中的差异DNA或差异cDNA得以富集。方法可重复性好,假阳性低,如果两处理间存在较大差异,以及某些基因在tester中存在上调表达时,用此方法达不到目的。2.5抑制性扣除杂交(SSH)1996年Diatchenko等提出SSH技术。此技术是以抑制PCR和杂交二级动力学为基础的DNA扣除杂交方法。其实验流程是提取tester和driver样本RNA,分离mRNA,反转录为cDNA,用识别四核苷酸位点的限制性内切酶酶切。将tester酶切产物等分为两份,分别连上接头Ⅰ和接头Ⅱ,各与过量的driver的cDNA进行第一次扣除杂交。杂交会得到四种产物:单链testercDNA,双链testercDNA,tester/drivercDNA,drivercDNA。第一次杂交后,将两份杂交产物合并,加入新的变性drivercDNA,进行第二次扣除杂交。这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA,产生了一种新的双链分子,它的两个5′端有两个不同的接头(接头Ⅰ和接头Ⅱ)。利用这两个不同的接头,使其在PCR中被有效地扩增。此技术效率高,假阳性低,敏感程度高,但mRNA量要求较高,mRNA丰度表达差别无法区别。2.6交互式扣除RNA差别显示技术(RSDD)RSDD技术是由Kang等1998年提出的,结合了扣除杂交和RNA差别显示两项技术。实验主要由三部分组成:交互扣除,差异分析,表达分析。交互扣除就是建立两个具有差别基因表达的样品cDNA文库,将这两个文库进行交互扣除杂交,获得两个扣除cDNA文库,再通过体内剪切得到质粒cDNA文库;差异分析就是对质粒cDNA文库的质粒进行PCR扩增(3种3′锚定引物和18种5′随机引物),经5%测序胶电泳分离并回收差异条带;表达分析是用反向Northern杂交和NorthernBlotting分析鉴定再扩增后DNA片段的差异表达。此技术假阳性低,重复性好,对mRNA表达水平轻度、中度改变也可识别。3蛋白质序列起始克隆根据中心法则,DNA转录成mRNA,再转译为蛋白质。因此,如果基因有最终的表达产物,得知蛋白质的氨基酸序列,就可以反推出原来DNA即基因的核苷酸序列。一般来说,是从N端对10多个连续氨基酸进行序列测定,选择连续6个以上简并程度最低的氨基酸,按各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库,从cDNA文库中筛选全长的基因。也可以使用该蛋白质特异的抗体筛选用表达载体构建的cDNA文库,通过抗原抗体反应寻找特异的克隆。这就是蛋白质序列起始克隆法。但是,在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因表达产物(蛋白质)是很困难的,蛋白质测序也花费较高,难度较大。4基于基本功能的分离方法4.1细菌、酵母基因的补很多基因可以通过在细菌、酵母中实现突变型互补来得到克隆。细菌或酵母的一些突变型通过接受外源的植物基因片段而得到功能互补,表现为野生型,那么转化的外源片段必定是编码表达细菌或酵母所突变的性状的基因。对于一些功能不清楚的基因,人们可以通过产生一表达反义的RNA活性的转基因植物来体现其功能。将特定的cDNA克隆连接到一个高度表达的启动子的下游,使其反义表达,这样就可以降低正常mRNA的表达活性,从而降低该基因产物的自然表达水平,这等于利用反义技术产生一个专一性的突变。4.2结构域与相互间的相互作用酵母双杂交体系(two-hybridsystem)又称双杂交系统、相互作用陷阱,是根据基因表达产物和功能来分离基因的。其基本原理是许多真核生物的转录激活因子都有两个结构域,即DNA结合域,转录激活域。将待研究的两种蛋白质分别与AD、BD融合转入表达系统,若此表达系统含有的报告基因可以转录,则证明这两种蛋白质能相互结合,存在相互作用。实验证实,不但异源的BD与AD融合形成的融合体蛋白质可以活化转录,由非共价键连接的两个结构域也可通过相互作用的蛋白质将BD与AD联系起来启动转录。鉴定已知蛋白质之间的相互作用是酵母双杂交系统的基本功能,并且双杂交系统可以筛选cDNA文库编码已知蛋白质特异成分。这种筛选不但揭示了许多已知蛋白质之间的相互作用,而且有助于发现许多新基因。5t-dna标签法生物基因组中的一段核苷酸序列的变化就会使该位点的基因发生突变。T-DNA或转座子随机插入到基因组的某一位点,引起该位点基因功能改变,这个位点就被标记,再利用T-DNA或转座子序列,用作探针对突变基因组文库进行筛选或设计引物扩增,就可以分离出标记位点的基因。T-DNAtagging是在土壤农杆菌的Ti质粒转化双子叶植物时,携带的T-DNA会随机插入到基因组中的某一位点或多个位点,使该位点的功能基因产生突变。T-DNA标签法的宿主范围有限,仅适用于受农杆菌介导的植物物种。转座子标签技术是利用转座子从一个基因座位转移到另一个基因座位引起的插入突变,使插入位置的功能基因失活而产生突变型,从而可以检测突变基因的位置并分离该基因。转座子标签法宿主范围很广,如玉米AC-DS转座子系统已被证明能在许多异源植物(矮牵牛、拟南芥、番茄、烟草等)中转座和标签基因。T-DNA和转座子作为植物基因的插入突变源已广泛应用于基因的标签和分离中。6aabchromosomew园林wac的构建目的基因区域的物理图谱图位克隆(map-basedcloning)根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座位,利用分子标记对目的基因进行精细定位,并用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括YAC、BAC、TAC、PAC或Cosmid库),从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromosomewalking)逐步逼近目的基因或通过染色体着陆(chromosomelanding)的方法最终找到含有目的基因的克隆,再经过遗传转化证实目的基因的功能。图位克隆包含4个主要技术环节:目的基因