不同硫离子浓度对超积累生态型东南天文重金属积累的影响

不同硫离子浓度对超积累生态型东南天文重金属积累的影响

随着工农业和人类生活的发展，土壤中的重金属污染日益严重，威胁到链中上部的人类健康。在众多的土壤重金属修复方法中,以植物修复为代表的生态修复方法以其廉价、安全的特点受到人们越来越多的重视。由杨肖娥等首次发现的原产于我国的Zn/Cd超积累生态型东南景天,其地上部对锌、镉及铅等重金属有极强的积累能力,而且生物量大、生长快,显示出良好的应用前景。众多前人的研究表明:小分子硫醇有机物如谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)、植物螯合肽(PC)、金属硫蛋白及有机酸等对于植物重金属耐性和积累能力方面有重要作用。本文以Zn/Cd超积累生态型东南景天为材料,研究总硫、GSH与Zn/Cd超积累的关系,为深入认识植物超积累的分子生理机制提供科学依据。1材料和方法1.1高水势梯度体的培养超积累生态型东南景天取自浙江省衢州市的一个废旧铅锌矿,用带有顶芽的茎段进行预培养后备用。预培养方法为:自来水培养生根后,经1/4营养液培养1周、1/2营养液培养1周、正常营养液培养1周。所有培养过程均在人工气候室内进行,相对湿度维持在70%~80%,白天温度26℃,夜间20℃,16h光照8h黑暗交替,每天调整1次pH值,每4d换1次营养液,通气培养。硝酸锌[Zn(NO3)2]和氯化镉(CdCl2)均为AR级,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2利用cdcl2进行苗分化经过预培养的苗用含1000μmol·L-1的Zn(NO3)2或200μmol·L-1的CdCl2营养液处理25d,每隔5d取地上部进行化学分析;另取一批苗也用1000μmol·L-1的Zn(NO3)2或200μmol·L-1的CdCl2处理,但营养液中的SO42-控制在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol·L-15个水平(如果SO42-处理浓度需要高出正常营养液水平,直接加入K2SO4;若需要低于正常营养液水平,则减少营养液配方中的K2SO4,补充KCl以维持正常的K+浓度),处理20d后测定地上部Zn/Cd含量。1.3吸光度的测定样品烘干后,用HNO3-HClO4消化,以空白样品为阴性对照,ICP-MS测定各处理的Zn/Cd含量;消化后的样品加入BaCl2在400nm下测定吸光值。用标准曲线换算各样品的总硫含量;GSH含量测定:于冰上研磨新鲜样品,按照南京建成生物工程研究所的GSH测定试剂盒说明书进行测定。实验数据均为3次重复的平均值,用MicrosoftExcelXP做统计学分析。2结果与分析2.1硫浓度对zn/cd积累能力的影响地上部Zn/Cd的积累都随着处理时间的增加而增加(图1),到25d时锌的积累量达到32280mg·kg-1,镉的积累量达到9380mg·kg-1,显示出极强的Zn/Cd富集能力以及作为重金属污染土壤修复的应用潜力。前15d地上部Zn/Cd积累量基本呈线性增加,后10d积累速度明显变缓。20d时地上部积累基本达到最大值,Zn/Cd含量分别达到31075mg·kg-1和9278.333mg·kg-1,所以在测试硫浓度对Zn/Cd积累能力的影响时,采用20d的培养时间。在根中,Zn含量先增加后下降(图2),前5d增加非常迅速,5~15d期间缓慢增加,15~25d又逐渐下降;镉含量也是在前5d迅速增加,但此后的20d一直下降。2.2mol3gf含量的变化地上部GSH含量在Zn/Cd处理的前15d呈逐渐增加趋势,到15d分别达到277μmol·kg-1FW和1610.5μmol·kg-1FW,15d后含量逐渐下降,到25d时分别下降到98.3μmol·kg-1FW和1010.5μmol·kg-1FW,相当于在处理5d时的GSH含量(图3)。在整个变化过程中,虽然Cd的积累量低于Zn,但Cd处理时所诱导的GSH含量都高于同时间点Zn处理时的诱导量,这说明Zn作为一种必须营养元素,在大量积累时对细胞的毒性低于Cd的毒性。2.3gsh在天麻体内的变化Zn/Cd处理时地上部总硫含量的变化趋势与GSH含量变化趋势基本一致,都呈现前15d上升后10d下降的变化趋势(图4),说明在景天体内GSH可能是硫存在的主要形式;同时也可看出含硫有机物不是锌镉积累的最终结合物质(不是重金属的最终配体),否则总硫含量应出现一直上升的趋势。2.4硫及gsh含量从表1可以看出,在低硫水平下(0.5、1.0mmol·L-1SO42-处理浓度时东南景天不显示缺硫症状)增加硫的供应可明显提高地上部Zn/Cd积累值,但供硫对Cd积累效果大于Zn,这与Zn/Cd处理不同时间下硫及GSH含量的变化趋势一致;但硫供应过多时,会导致积累能力逐渐下降,其原因与含硫有机物不是Zn/Cd积累的最终配体有关,当然也可能是硫中毒所致。3超积累植物的基因表达从超积累东南景天整株植物的积累曲线看,Zn处理的前15d,地上部Zn积累量呈线性增加,根中Zn含量也表现出增加趋势;在Zn处理的后10d时间里,地上部Zn积累速度逐渐降低,地下部Zn含量也逐渐下降,表明作为必需营养元素的锌离子从根部的吸收到地上部的积累是主动代谢的结果。而镉处理时,根部的积累量在5d时就已经达到最大值,地上部在20d时才接近最大值,表明镉元素做为一种有毒的、非必需重金属离子,其吸收和积累是一个被动的过程。在众多重金属对植物的影响研究中,基本都是研究重金属胁迫的短期效应,GSH的诱导量都是随处理时间的增加而增加。在本研究长达25d的处理时间内,无论是锌还是镉处理,GSH都呈现出低-高-低的变化趋势,但地上部重金属Zn/Cd离子的积累量却一直上升。结合分析Zn/Cd离子的积累速度,推测其可能原因是:在处理的前15d,由于往地上部的运输速度较快,而最终起螯合作用的配体的合成速度落后于运输速度,造成细胞内游离态的Zn/Cd离子逐渐增加,进而需要越来越多的GSH来解除其毒性,从而造成前期GSH含量呈增加的变化趋势;而在后期,地上部Zn/Cd离子的积累接近饱和时,可能会产生一种信号物质,而这种信号物质将抑制根部Zn/Cd离子继续吸收和向地上部的转运,使得地上部细胞内游离态Zn/Cd离子含量降低,因而只需要较少量的GSH即可解除毒性。总硫的变化说明含硫有机物不是锌镉积累的最终配体,这与SunQ等人的研究结果相似,他们用Zn/Cd/Pb处理超积累东南景天时也未发现PC的诱导,而PC是另外一种以GSH为底物合成的含硫有机物,已被证明在多种重金属超积累植物中起重金属配体作用。Isaure等发现在拟南芥叶中Cd主要与O/N键结合在细胞壁中,只有少部分是与SH-