酵母双杂交系统的研究进展

酵母双杂交系统的研究进展

0蛋白质在细胞生命活动中的作用随着药理学的发展，人们对生命的研究逐渐从基因形成时代转向后基因组时代。蛋白质间相互作用的研究是后基因组时代的重要组成部分,对蛋白质相互作用的认识可以更好地理解生命的本质,众所周知蛋白质在细胞生命活动过程中起着非常关键的作用。酵母双杂交系统是体内分析蛋白质间相互作用的一种有效的遗传学方法,而过去也有许多方法用来研究蛋白质间的相互作用,但都是体外研究方法如交联、免疫共沉淀、亲和层析等,这些方法容易受外界条件的影响,还需要纯化蛋白,同时要求蛋白质间存在比较强的作用力,而酵母双杂交系统操作是在核酸水平上进行,是在酵母细胞内研究蛋白质间的相互作用,并且还能检测到蛋白质间微弱的相互作用,无需对蛋白质进行纯化,因此自从该技术建立以后,得到了迅速广泛的应用。1转录激活结构域和转录激活结构域酵母双杂交系统由Fields和Song等于1989年首先在研究真核基因转录调控中建立,此系统是在酿酒酵母体内分析蛋白质间的相互作用。真核生物转录调控过程的认识为酵母双杂交系统的建立奠定了基础,其理论依据为典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有两个可分离的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,简称为DB)和转录激活结构域(transcription-activationdomain,简称为AD),前者负责识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,后者与转录复合体的其他成分作用,启动所调节基因的转录,这两个结构域结构上相互独立但功能上又相互依赖,一个完整的转录因子必须同时含有这两个结构域,否则将无法完成转录激活功能。酵母双杂交是将BD的核酸序列与诱饵蛋白X的核酸序列结合构建成BD-X融合表达载体,X往往是已知蛋白,将AD的核酸序列与猎物蛋白Y的核酸序列结合到一起构建成AD-Y表达载体,之后将这两个质粒共同转入同一酵母细胞内表达,如果X和Y之间存在相互作用,那么与他们分别融合的BD和AD在空间上就能充分接近,呈现出完整的转录因子活性并激活相应报告基因的表达,而单独的BD和AD均不能激活报告基因。通过检测报告基因表达与否,就可以很容易地判断出X和Y之间是否存在相互作用,当把Y变成基因文库或cDNA文库时,就可以直接从文库中找到与X相互作用的蛋白的DNA序列。2从一般的角度解释和界定蛋白质,主要特点如下酵母双杂交系统与其它研究蛋白质间相互作用的方法相比其主要表现在:(1)发现和研究在活细胞体内的蛋白质间的相互作用,转录因子功能是在融合基因表达后,在细胞内重新组建转录因子之后发挥作用的,不需要分离纯化蛋白质,这就避免了在提纯蛋白过程中可能引起蛋白变性,因此保持了蛋白的生物活性,能更真实地反映体内相互作用的真实情况。(2)可以直接从文库中获得相互作用蛋白的核酸序列。(3)能敏锐地通过报告基因检测到蛋白间微弱的、瞬间的作用,是一种研究蛋白间相互作用非常灵敏的技术。(4)酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。(5)常用酵母细胞作为报道株,具有直接进行选择的标记基因,易于转化、便于回收扩增质粒,同时酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合等特点和优点。3假阳性和假阴性的联合用药酵母双杂交系统是分析蛋白质间相互作用的一种非常有效的方法,自从建立以来,得到广泛的应用,但仍存在一些局限性,容易出现假阳性和假阴性,而且对蛋白质在细胞中的定位有非常严格地要求,同时转化效率偏低。3.1酵母细胞激活假阳性就是指待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活,假阳性发生频率较高,归纳起来有以下几个原因:某些蛋白质本身具有转录激活功能如转录因子,就无需BD和AD相互作用就能激活报告基因表达或者是在酵母表达时发挥了转录激活作用;两个相互作用的蛋白质在原宿主内不在同一种组织或细胞内表达,或者是在发育的不同时期、同一种细胞的不同区域表达,利用此系统分析把这些在生理状态下是不可能碰到一起的蛋白拉到一起进行相互作用而导致假阳性结果的出现;某些蛋白表面含有的多种蛋白质低亲和力区域,也会导致报告基因的表达,产生假阳性结果;酵母细胞内还存在其他因素的影响,有时会把两个原本无直接相互作用的蛋白拉到一起,从而激活报告基因的表达。针对这些缺陷,可以通过做严格的对照试验排除假阳性,应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定,也可以采用双筛选系统以减少假阳性的发生。3.2蛋白间的相互作用假阴性是指两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度非常低以至于检测不出来。原因是有些融合蛋白的表达对细胞会产生毒性,这时应该选择敏感性低的菌株或低拷贝数的载体去避免;也有可能是蛋白间的相互作用较弱,这时应选择高敏感的菌株及多拷贝载体去避免;还有就是此系统分析蛋白质的相互作用是定位于细胞核内,这就造成此系统对所有蛋白质并非都适用,对于核外蛋白就不能用此系统分析相互作用,因为它们的相互作用不是发生在核内,如果用此系统就会出现假阴性结果;同时许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行,另外在酵母中大量表达融合蛋白有可能会影响目的蛋白的修饰和折叠,尤其是在研究异源蛋白相互作用时,它们的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,因此不能正确修饰和折叠的蛋白质也会导致假阴性结果的出现。3.3共转化和共转化如何提高转化效率也是酵母双杂交文库筛选时应给予高度重视的一个问题,在双杂交系统筛库过程中转化BD-X载体和AD-Y载体时可以依次转化,也可以共转化,这两种方法相比之下共转化更具有优势,首先它比较节省时间,工作量也没有依次转化时的工作量大,其次共转化还可以减弱或消除融合表达蛋白大量表达对酵母产生的毒性,尤其对一些低表达量的基因进行筛库时,就更应该提高转化效率,才有可能筛到与目的蛋白有作用的蛋白质,利用酵母的有性生殖即酵母接合型的引用可以更有效地提高双杂交的转化效率。4酵母双杂交系统检测功能酵母双杂交系统产生以来,主要应用在以下几方面:可用来寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白,这是双杂交系统最广泛、最有价值的应用。比如将感兴趣的目标蛋白基因克隆至BD载体,而将要筛选的cDNA库克隆在AD载体,共同转化酵母宿主菌,如果cDNA序列编码的某一段蛋白能和靶蛋白形成聚合体,就会激活报告基因,这样就可以找到一个与靶蛋白结合的新蛋白,目前使用双杂交系统已经筛选到许多新蛋白,而且在不断扩大;确定功能已知蛋白间的相互作用或已知有生理作用的蛋白间的作用位点、结构域、关键氨基酸残基,通过构建待测蛋白的缺失突变体,检测不同缺失突变体报告基因的表型可以判断出在相互作用中起关键作用的功能结构域,之后在功能结构域内进行DNA点突变,改变其氨基酸残基,以确定突变体能否使报告基因表达,就会找到蛋白质间相互作用的必需氨基酸;验证通过其他方法发现的蛋白间的相互作用;分析新基因的生物学功能,即以功能未知的新基因去筛选文库,然后根据钓到的已知基因的功能推测新基因的功能;此外酵母双杂交系统还应用于绘制蛋白质联系图谱等许多方面。该系统现已被广泛应用于各个领域的研究中,如信号转导、蛋白质功能、癌基因研究、细胞凋亡研究、细胞周期与分化、绘制蛋白质相互作用图谱、基因表达调控以及药物设计等领域,但是此系统只能反应蛋白间可能发生相互作用,而在生物体内的真实情况是不是正如实验所显示的还没有报道,因此实验结果还需要其它研究方法来验证。有研究指出用酵母双杂交系统获得的相互作用的蛋白网络估计会有近50%的假阳性,尽管如此,酵母双杂交系统还是大大推动了蛋白质相互作用的研究,在蛋白质相互作用的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交系统是在真核细胞内从基因水平分析蛋白与蛋白间相互作用的一种灵敏而