紫外诱变选育米曲霉y25菌株及其应用研究

紫外诱变选育米曲霉y25菌株及其应用研究

目前，我国的生产区主要采用美国曲霉3.042作为发酵菌。发酵菌的特性决定了生产工艺的选择，并对产品的口感、质地和质量起到了决定性的作用。近年来人们通过各种诱变手段不断选育米曲霉新菌种,如采用紫外线对米曲霉沪酿3.042菌株进行诱变,最后得到突变株LY06的蛋白酶活力是原菌株的1.78倍;利用N+离子注入法对米曲霉沪酿3.042菌株进行诱变,其突变株TK-7的蛋白酶活提高36%;采用亚硝基胍和紫外线复合诱变米曲霉A.o-2原生质体,得变异株N-4,其蛋白酶活力比出发株提高32.6%。国外这方面的研究也很多,如井口氏对生产菌种曾进行过X线照射诱变,得到蛋白酶活力比原出发菌株高2倍的X-816菌株,那须野氏再次诱变,把X-816的蛋白酶提高到6倍,所得到的变异株与原出发菌株的酶系统没有改变;利用γ射线诱变最终得到了高产α-淀粉酶的米曲霉菌株;采用亚硝基胍和紫外线复合诱变米曲霉ATCC22788得到了高产曲酸的菌株。工业微生物菌种选育的目的旨在能够提供一株质量优异的菌株,该菌株应具备性状优良且遗传性能稳定的特点,因此有必要不断发掘新菌种或改良现有菌种以满足工业生产的要求。但是从自然界分离出来的野生菌株通常是性能和耐受性差,遗传不稳定,往往不能满足工业生产的要求,因此采用不同的手段进行菌种选育是必不可少的。在制酱过程中采用不同的米曲霉菌种制曲将会产生不同的风味和营养,这是因为酱发酵是它所分泌的多种酶综合作用的结果,其中最重要的是蛋白酶和淀粉酶。本研究以从具有东北地区特色的自然发酵酱中分离的野生米曲霉菌株为研究对象,通过紫外诱变筛选出蛋白酶活力高、综合性状优良且适合工业化生产的菌株,为进一步理论研究及应用提供了良好的菌种资源。1材料和方法1.1k107和k109菌株的分离米曲霉(Aspergillusoryzae)K83、K61、K102、K107和K109菌株由哈尔滨工业大学食品工程实验室提供,其分别分离自哈尔滨、佳木斯、齐齐哈尔、牡丹江和鸡西地区的自然发酵酱中;米曲霉(Aspergillusoryzae)沪酿3.042菌株购于黑龙江省微生物研究所。1.2acl22h2o蛋白酶活力初筛培养基:干酪素4g,KH2PO40.36g,Na2HPO4·7H2O1.07g,ZnCl20.04g,CaCl2·2H2O0.002g,MgSO4·7H2O0.50g,FeSO4·7H2O0.002g,NaCl0.16g,TC(胰蛋白胨)0.03～0.05g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH=7,1×105Pa灭菌15min。蛋白酶活力复筛培养基:麸皮12g,豆粕3g,pH6～7的蒸馏水8mL,装于250mL三角瓶中,1×105Pa灭菌30min。1.3原料缓冲黄豆、面粉和水。1.4诱导变量试验1.4.1复筛培养基酶活力测定随机挑取米曲霉K61为待测菌株,吸取0.5mL孢子悬液(108个/mL)接种于蛋白酶复筛培养基中,30℃恒温培养,每隔6h取样并测定其酶活力,其方法按以下标准进行:蛋白酶活力(ZBX66030-87);α-淀粉酶活力(QB/T1803-1993);糖化酶活力(QB/T1803-1993);水分(GB4800-84)。1.4.2产酶活力测定以来自东北地区有代表性的5株米曲霉为筛选对象,以米曲霉沪酿3.042菌株为对照,培养方法同上,于产酶高峰测定蛋白酶(酸、中、碱)、α-淀粉酶和糖化酶活力。1.4.3强制安装条件的选择按参考文献进行。1.4.4培养方he值测定采用干酪素平板水解透明圈法进行初筛,分别测定HE值(HE值=透明圈直径/菌落直径),选择HE值较对照大者移入豆芽汁斜面,培养保存备用。1.4.5角瓶培养水泥基蛋白将经过初筛后所得菌株,吸取0.5mL孢子悬液(108个/mL)接种于装有蛋白酶活力复筛培养基的三角瓶中,于30℃的恒温箱中培养,于酶活高峰测定其蛋白酶(酸、中、碱)活力。1.4.6遗传稳定性试验将复筛得到的菌株在豆芽汁斜面上连续传代8次,每次传代后在蛋白酶复筛培养基中培养测定其蛋白酶(酸、中、碱)活力。1.5性能试验和质量试验1.5.1糖化酶活力测定蛋白酶(酸、中、碱)、α-淀粉酶和糖化酶活力测定方法同上,生长量的测定采用直线生长法,孢子数测定采用悬滴法(ZBX66028-87)。1.5.2y29美国菌和y29上海霉的质量试验酿造酱采用固态低盐发酵法,其质量标准按ZBX66019-87进行。2结果与讨论2.1以诱导突变为基础的蘑菇选择2.1.1淀粉酶活力结果随机挑取米曲霉K61菌株为待测菌株,蛋白酶活力曲线见图1,可以看出,米曲霉K61菌株在54h酸性蛋白酶活力出现高峰,在66h碱性蛋白酶活力出现高峰,在72h中性蛋白酶活力出现高峰,这种先后顺序与邱雁临等所报道的结果一致。淀粉酶活力曲线见图2,可以看出,糖化酶的酶活高峰出现在64h,而α-淀粉酶的酶活高峰出现在72h。只有在酶活高峰测出的结果才具有可比性,该实验结果为下一步试验在酶活测定方面提供了依据。2.1.2不同菌株的活性于产酶高峰分别测定了5株野生菌株和米曲霉沪酿3.042菌株的蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶,糖化酶)活力,从表1可看出(α=0.05),这5株野生株的各项指标差异不显著,这是因为它们都是来源于自然发酵酱中的野生米曲霉菌株,但它们与米曲霉沪酿3.042菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力差异显著;虽然这5株菌的淀粉酶(α-淀粉酶,糖化酶)活力与米曲霉沪酿3.042菌株差异均不显著,但仍略高于3.042菌株。本试验的目的是提高供试菌株的蛋白酶活力,经综合评价,最终以其中最优良菌株K61为供诱变出发菌株。2.2紫外诱变菌株的筛选结果采用紫外线进行诱变,由经验可知,致死率达到75%左右时,产生正突变的几率较高,有利于进一步筛选。以米曲霉K61菌株为待诱变出发菌株,由表2可知,处理时间为9min时,致死率为72.7%,符合紫外诱变要求。由于本试验供诱变孢子悬液浓度为1×108个/mL,诱变后当稀释倍数为104时,每平板上菌落太多以致无法计数;稀释倍数为105时,虽然菌落数可计但抑菌圈看不清,稀释倍数为106时,效果最佳。所以诱变条件为20W紫外灯,距离25cm,照射时间9min,稀释倍数106。2.3y2/maol-4/hp1突变株的体外膜活动酶活力检测以米曲霉K61菌株为出发菌株,经紫外诱变后首先在干酪素平板上初筛(见图3),然后采用蛋白酶复筛培养基进行复筛。在初筛时,以米曲霉沪酿3.042菌株为对照,挑选到10株变异株,其HE值均大于对照K61菌株。随后对这10株变异株进行复筛,当菌落直径比较大时,HE值越大,蛋白酶活力就越高;Y24菌株的HE值虽然很大,但它的菌落直径小,只有0.41cm,所以它在培养过程中的生物量也少,其总酶活就不高。其中9株变异株的蛋白酶(酸、中、碱)活力均高于出发菌株,但只有米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力高于对照米曲霉3.042菌株,所以将其定为目标菌株进一步研究。本试验所采用的方法测得的蛋白酶活力(酸、中、碱)是所有的蛋白酶在不同的pH(3、7.2、11)条件下的综合活力,所以到底是哪种蛋白酶的活力提高了,提高的分子基础是什么还有待于进一步研究。2.4米曲霉y29菌株的遗传稳定性米曲霉Y29菌株经斜面传代8次并培养后测定其蛋白酶和淀粉酶(α-淀粉酶和糖化酶)活力,其酸性蛋白酶活力范围为1470.67～1558.93U/g,中性蛋白酶活力范围为9100.23～9242.77U/g,碱性蛋白酶活力范围为5976.21～6155.23U/g,α-淀粉酶活力范围为85～92U/g,糖化酶活力范围为2530～2600U/g,说明米曲霉Y29菌株在传代过程中的酶活力变化不显著,其遗传性能稳定。2.5y29美国菌和y30株的性能、风味和质量分析2.5.1淀粉酶、糖化酶、生长速度和芽孢率从表3可看出,米曲霉Y29菌株的蛋白酶活力明显高于米曲霉3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标差异并不显著。米曲霉Y29菌株的缺点是α-淀粉酶活力还很低,有报道来源于韩国的米曲霉KFRI888的α-淀粉酶的活力达256U/g,所以今后可以从这方面加以改良,使之成为适应工业生产的优良菌株。2.5.2其它指标测定由表4、表5可看出,利用米曲霉Y29菌株酿造的酱的氨基酸态氮含量更高一些,它的酱香更浓郁一些,到底是哪些呈味氨基酸和风味物质导致这种差异,还有待于进一步研究,其它指标均符合国家标准ZBX66019-87。米曲霉Y29菌株制酱发酵终点的pH为5.03,略低于米曲霉3.042菌株发酵终点的pH值,这可能的原因有两点,一是米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力比较高,分解形成不同量的氨基酸,二是米曲霉Y29菌株的淀粉酶活力略高于3.042菌株,能形成更多的糖类,如麦芽糖和葡萄糖等,这些糖再被乳酸菌利用所致。3y29的酶活力从五株野生米曲霉菌株中筛选出优良菌株