双水相萃取分离果胶酶的研究

双水相萃取分离果胶酶的研究

双水相萃取系统通常由两种水生聚合物或两种水生聚合物组成，以及由盐和水组成的三个单相系统。近年来,该萃取技术受到研究者的青睐,尤其是它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化等方面受到广泛重视,双水相萃取在提取生物活性物质方面有如下优点:含水量高;分相时间短;界面张力小;不存在有机溶剂残留问题;大量杂质能与所有固体物质一同除去;易于工程放大和连续操作;更重要的是双水相萃取避免了传统液-液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触,保护了其活性,有研究表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用,反而有稳定作用。果胶酶在食品、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂行业应用十分广泛。而我国果胶酶的生产技术很不成熟,提取分离中效率低、酶易失活是要重点解决的问题之一,双水相萃取技术用于果胶酶的研究未见文献报道。因此,本研究对双水相技术提取果胶酶进行了初探,以PEG/(NH4)2SO4双水相体系为考察对象,比较了不同浓度的PEG和(NH4)2SO4组成的双水相体系对果胶酶的萃取效果,并考察了影响萃取效果的各种因素。1材料和方法1.1硫酸铵、dm、d、b、酸钠、苯酚、酒石酸钠、苯酚PEG(分子量为400、600、1000)、硫酸铵、DNS、氢氧化钠、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、苯酚,均为市售分析纯;果胶粉Sigma公司;果胶酶实验室保存。1.2精密测试设备800型离心机上海手术器械厂;棱光可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;精密pH计雷磁仪器厂;电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司;FA2104S电子天平上海精密科学仪器有限公司;WH-3微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂。1.3方法1.3.1peg/nh42so4质量百分浓度的测定将不同分子量的PEG和(NH4)2SO4制成一定浓度溶液,准确量取一定量PEG溶液,加入试管中,然后加入(NH4)2SO4溶液,混合至试管开始出现混浊为止,离心分离或静置分离成相即可得到PEG/(NH4)2SO4双水相体系,根据加入的(NH4)2SO4溶液的量,算出PEG和(NH4)2SO4及水在系统中的质量百分浓度。1.3.2萃取分相及酶活力测定参照上述的成相条件,计算双水相系统所需成相物质的量,混匀后用离心刻度试管离心分离使其成相,测定相体积比R(R=Vt/Vb),量取适量体积的酶液,与PEG/(NH4)2SO4双水相体系混合,在室温下进行萃取分相,分相完全后分别测定上下相中的酶活力。1.3.3酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS比色法)测定果胶酶的酶活性。1.3.4分配系数的测量分相后上相酶活与下相酶活的比值,以K表示。2结果与分析2.1peg对果胶酶活性的影响将PEG400、PEG600、PEG1000分别配成质量百分浓度为30%的溶液,准确吸取5ml不同分子量的PEG溶液,分别加入1ml稀释50倍的酶液,混匀10min,测定不同分子量PEG中的酶活。对照样用5ml蒸馏水加入1ml稀释50倍的酶液,以酶活活性比(X)为指标,考察成相物质对酶活性的影响。X按下列公式进行计算:实验结果表明,在所选定三种PEG中,PEG1000的溶液中酶活活性比最大,说明其对果胶酶活性的影响最小。故选取PEG1000为双水相系统成相物质。2.2萃取相总浓度对产品品质的影响用不同浓度的PEG1000构成PEG/(NH4)2SO4双水相体系,分别测定果胶酶在不同的双水相体系中的分配系数,实验结果如表1所示。实验表明,当(NH4)2SO4浓度一定时,随着PEG1000浓度的增加,果胶酶的分配系数K也在增加。改变成相物质在双水相体系中的总浓度,实际上是改变了操作的加料点。从双水相的相图可知,体系中成相物质的总浓度增加时,体系将远离临界点,同时系线长度增加,两相性质的差别增大。在成相的三种物质:(NH4)2SO4、PEG1000和H2O中,PEG1000是极性最小的一种,其浓度增加,萃取相的极性减小,果胶酶是具有部分极性的非极性物质,因而其溶解度增加,所以果胶酶的分配系数增加。PEG1000浓度增加的同时也增加了相比,所以,增加PEG相的PEG1000浓度对分配系数和产量的提高都是有利的。但PEG1000浓度太高,使萃取相的极性降低太多,使具有强极性的(NH4)2SO4的溶解度降低甚至不溶,破坏了双水相的形成条件,不能成相,萃取过程受到影响,在本实验中,选择PEG1000的浓度为27%,在此条件下,体系有较高的分配系数。2.3so4对果胶酶分配的影响在PEG1000浓度不变的情况下,改变PEG/(NH4)2SO4双水相体系中(NH4)2SO4的浓度,分别测定果胶酶在不同的双水相体系中的分配系数,实验结果如表2所示。由以上数据可知,在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中,控制PEG1000的百分含量为27%,(NH4)2SO4的百分含量为19%时,果胶酶的分配系数K可以达到最大值,K=11.42。2.4ph对果胶酶分配系数的影响固定PEG1000的百分含量为27%,(NH4)2SO4的百分含量为19%,考察不同pH对果胶酶分配系数的影响,实验结果如图1所示。由图1可知,果胶酶的分配系数K值随pH值的增加先是增加达到最大值后逐渐下降,当pH增加到5.0时,果胶酶在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中有最大的分配系数K=11.40。结果与果胶酶在pH5.0附近活力较强是一致的。2.5最适条件的确定固定PEG1000的百分含量为27%,(NH4)2SO4的百分含量为19%,pH为5.0,考察不同质量分数NaCl对果胶酶分配系数的影响,实验结果如图2所示。结果表明:随着NaCl质量分数逐渐增大,分配系数K先增大而后减小,在NaCl质量分数为0.002%时K有最大值14.0。通常果胶酶的活性范围在pH3.0~9.0之间,等电点在pH4.0~9.0之间,在最适pH4.0~6.5之间的酶为水解酶。商品果胶酶是各种酶构成的混合物,pH5.0条件下,不同的果胶酶成分可带有正或负电荷(等电点PI>5.0的果胶酶带负电荷,PI<5.0的果胶酶带正电荷),NaCl粒子可能在两相中有不同的分配系数,因而,随着盐浓度的增加,两相间的电位差发生变化,因而使果胶酶的分配系数增加,但盐浓度增加到一定程度后,萃取相的极性增强,使果胶酶的溶解度下降而发生盐析作用,分配系数明显降低。2.6温度对萃取分离的影响固定PEG1000的百分含量为27%,(NH4)2SO4的百分含量为19%,考察不同温度对果胶酶分配系数的影响,实验结果如图3所示。由图3可知,温度对果胶酶的分配系数K有一定的影响,温度小于50℃时,随着温度的升高,果胶酶分配系数K逐渐增加,这是由于溶液温度上升后,分子运动加强,削弱了静电排斥作用的影响,导致果胶酶分配系数增加。当温度大于50℃之后,分配系数K随温度的升高而逐渐减小,出现这种现象的原因是由于高温引起部分酶失活,使果胶酶的分配系数K减小。对于PEG1000的百分含量为27%,(NH4)2SO4的百分含量为19%的PEG/(NH4)2SO4双水相系统,温度为50℃时,分配系数K=12.65,最有利于萃取分离。结果与果胶酶在40~50℃时有较高活性相一致。3peg/nh42so4的双水相系统为3.1在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中,对所选定的成相物质PEG,其分子量在1000时测得的酶活性最大,说明PEG1000对果胶酶活性的影响最小。故选取PEG1000为双水相系统成相物质。3.2通过对浓度PEG/(NH4)2SO4双水相系统进行考