高产蓝色素酵母基因工程菌的发酵条件优化

摘要.2国内外研究现状近年来，市场对天然靛.蓝.的需求与日俱增,目前在国内外市场上靛.蓝.主要应用于纺织业如棉织物、羊毛、丝.绸的染色方面,在地毯和手工艺品上也有应用[2]。像美国和韩国，通过编辑大肠杆菌基因的技术产生天然生物靛蓝，有效地应用于织物中。当下，食品工业化的快速发展，全球对于食品色素的需求量口益增加。其中，食用红色素和食用黄色素较之蓝色素附占来源极为广泛，目前食用的蓝色素的种类很少，且来源非常有限。目前在我国广泛使用的食用蓝色素主要是靛蓝色素、扼了蓝色素和藻蓝蛋白（即藻蓝素）三种[3]。我国早在3600年前的夏朝就使用植物靛蓝染料，它是蓝草（菘蓝、蓼蓝、马蓝等）经发酵提炼后制得的最早的天然染料，主要含有靛蓝和靛玉红（5%~20%）两种色素成分，及少量的靛棕、靛黄等色素[4]。经其染色纤维及纺织品色调高雅、手感丰满、安全健康，并具有良好的药用价值（抗菌、消炎等）和较高的艺术价值（扎染、蓝印花布等），但也存在成本较高、染色重现性较差等缺点[5]。1.2.1靛蓝色素的合成机理早在1928年研究人员就发现假单胞菌（Pseudomonasindoloxidaes）能够氧化吲哚合成靛蓝。目前已发现多种微生物能够合成靛蓝，如以萘为碳源的Pseudomonasputida菌株PpG7、有能够降解甲苯-二甲苯其它衍生物的P.putida菌株mt-2、降解甲苯的P.mendocina菌株KR1、降解苯乙烯的P.putida菌株S12和CA-3、以1，2，3，4四氢化萘为碳源的Sphingomonasmacrogolitabida等。当前，靛蓝生物转化的研究已经从筛选自然界中能够合成靛蓝的菌株，发展到进行工程菌的构建，并从实验室研究开始进入工业化生产。但是在构建高效工程菌株、优化发酵参数、简化靛蓝提取过程等方面，仍然有待进一步的研究与开发。靛蓝色素是一种脂溶性偶氮类色素，能够溶解于少数几种有机溶剂，且稳定性较差，容易褪色,目前关于环境因素对靛蓝稳定性的研究较少，靛蓝降解机制仍不明确。1983年Ensley等发现，吲哚可被双加.氧酶转化成3-羟基吲哚（吲哚酚），而3-羟基吲哚在接触空气后被氧化成靛蓝。由此，初步阐明了靛蓝生物转化的机制[5]。后期研究发现，具有合成靛蓝能力的微生物大多数都是芳烃降解菌，通过单加氧酶或双加氧酶催化吲哚或其氧化物合成靛蓝色素。与化学合成色素相比，微生物发酵不受原料资源限制，且具有高效、高选择性、条件温和以及绿色安全等特点。野生型菌株催化合成靛蓝体系中因存在旁路反应、副反应，靛蓝产量一般较低。因此，利用基因工程技术构建催化靛蓝合成关键酶的超量表达菌株，是提高靛蓝生物合成量的有效途径。以吲哚为底.物.合成靛蓝Fig.1Synthesisofindigoviaindoleassubstrate与靛.蓝.生物转化有关的酶主要是单加氧酶和双加氧酶。有的单加氧酶，通过参与甲苯和1-萘酚的代谢，形成靛蓝，有的单氧酶，将吲哚催化为3-羟基吲哚，然后二聚化为靛蓝[6]。在靛.蓝.生物转化中，其催化机制为催化吲哚形成双羟基酚，然后脱水形成吲哚酚，最后在空气中氧化聚合形成靛蓝[7]。第2章实验器材及方法2.1实验材料2.1.1实验药品表2-1实验过程中使用到的药品项目试剂名称生产商1葡萄糖北京市永大化学试剂有限公司2蛋白胨北京市致远化学试剂有限公司3酵母提取物贵阳太阳生物科技有限公司4琼脂粉烟台生工有限责任公司5AgarCOOLABERSCIENCE6DOSupplemen-UraCOOLABERSCIENCE7半乳糖重庆市宏宇生物有限公司8DMSO昆明浦东试剂厂2.1.2实验器材表2-2实验所需仪器项目实验仪器型号∕规格生产厂家1电子天平FA2004A北京菁海有限公司2旋涡震荡器G560E北京生物科技有限公司3超净工作台SW-CJ-20D北京晟源分析化学仪器制造有限公司4多功能层析柜GYCX-890江苏国仪有限公司5高压蒸汽灭菌锅SX-300上海易联医疗器械厂6实验室pH计FE20梅特勒托利多仪器（上海）有限公司7数显恒温水浴锅HH-1江苏金坛市江南仪器厂8台式高速微量离心机Hico21北京珂淮仪器有限公司9高速离心机CF16RNHitachiKokiCo.Ltd.TokyoJapan10医用低温保存箱MDF-86V340苏州贝锐仪器科技有限公司11酶标仪EPOCHBopTekInstruments，Inc12医用冷藏箱YC-80澳柯玛股份有限公司13电热恒温培养箱ZXSD-R1270常州生物质能研究所2.1.3实验试剂YPD液体培养基Y表示酵.母提取物、P表示蛋.白胨、D表示葡.萄糖；其中各物质比例为：蛋白胨2%，无水葡.萄.糖2%，酵母提取物1%，用适量去离子水充分溶解。高温蒸汽除菌（103.4kPa、121℃、15min）。SD液体培.养基，其中各物质比例为：DOSupplemen-Ura1.29%，无酵母氨基氮源0.67%，无水葡萄糖2%，它们三种物质须分别配制。三种物质的加水比应为DOSupplemen-Ura[8]：YNB：无水葡萄糖=8：1：1。无水葡萄糖采取高温蒸汽除菌（103.4kPa、121℃、15min）的方式进行分别单独灭菌[9]。待灭菌完成温度均降至55℃以下后将无水葡萄糖溶液加入SD溶液中，20%葡萄糖溶液配置100m葡萄糖溶液，称取20g葡萄糖放入锥形瓶，量取80mI蒸馏水加入锥形瓶中，密封放入高压蒸汽灭菌锅（103.4kPa、121℃、15min）的方式进行灭菌。2.1.5实验菌株BJ5464（由吉林省生物质清洁转化与高值化利用科技创新中心保存）；2.1.6.灭菌、培养基、配置溶剂、离心管、滤器还有各种型号的枪头等都要进行高压蒸汽灭菌。这种常见的物理灭菌方式适用于普通培养基（例如SD培养基、YPD培养基）[10]。高压蒸汽灭菌的公认标准为：在103.4kPa（1.05kg/cm2）的压强下（即在1.02倍大气压下），温度上升至121.3℃时灭菌15min。另SD培养基中葡萄糖应配置葡萄糖溶液，与SD培养基分开灭菌，避免高温引起葡萄糖变性。进行统一灭菌后，再将葡萄糖加入SD培养基中。2.2实验方法2.2.1外加色氨酸或吲哚对发酵产靛蓝的影响实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph为6.5，因为酵母的最适PH为6.5，而新配制的SD培养基与YPD培养基的PH呈酸性，不适合酵母生长。同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形。下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液体积1%接菌，此时SD培养基体积为40mI，故吸取400uI种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD+色氨酸培养基，离心管，1M吲哚溶液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。进行外加色氨酸5mI体系培养时，取2.5mISD菌液加入到离心管中，同时取2.5mI的YPD+色氨酸培养基2.5mI，平行两组，设置色氨酸的浓度梯度为5mmol/L;10mmol/L;20mmol/L;40mmol/L;做好标记。在外加吲哚的5mI体系中，取2.5mISD菌液加入到离心管中，同时加入2.5mIYPD培养基溶液，设置吲哚浓度分别为1mmol/L；2mmol/L；4mmol/L；8mmol/L；做好标记。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养48h.取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量。2.2.2温度与摇床转速的影响实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph为6.5，因为酵母的最适PH为6.5，而新配制的SD培养基与YPD培养基的PH呈酸性，不适合酵母生长。同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形。下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液体积1%接菌，此时SD培养基体积为40mI，故吸取400uI种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD培养基，离心管。每种温度及转速的摇床设置平行实验两组，做好标记。取2.5mISD培养菌液加入到离心管中，再取2.5mI的YPD培养基加入到离心管中，并加入适量的吲哚。将离心管分别放置在三种不同的摇床中，培养48小时。取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量。2.2.3PH对发酵产靛蓝的影响（1）实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph浓度梯度为4.0-10.0，共七组，同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形。（2）下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.（3）隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液体积1%接菌，此时SD培养基体积为40mI，故吸取400uI种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.（4）隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD培养基，离心管。每种温度及转速的摇床设置平行实验两组，做好标记。取2.5mISD培养菌液加入到离心管中，再取2.5mI的YPD培养基加入到离心管中，并加入适量的吲哚。将离心管分别放置在三种不同的摇床中，培养48小时。（5）取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量。2.2.4接种量对发酵产靛蓝的影响（1）实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph为6.5，同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形。（2）下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.（3）隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分别按SD溶液体积0%，0.5%，1%，1.5%，2%接菌，吸取种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.（4）隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD培养基，离心管。每种温度及转速的摇床设置平行实验两组，做好标记。取2.5mISD培养菌液加入到离心管中，再取2.5mI的YPD培养基加入到离心管中，并加入适量的吲哚。将离心管分别放置在三种不同的摇床中，培养48小时。（5）取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量2.2.5发酵时间对产靛蓝的影响（1）实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph为6.5，同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形[18]。（2）下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.（3）隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分别按SD溶液体积1%接菌，吸取种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.（4）隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD培养基，离心管。每种温度及转速的摇床设置平行实验两组，做好标记。取2.5mISD培养菌液加入到离心管中，再取2.5mI的YPD培养基加入到离心管中，并加入适量的吲哚。将离心管分别放置在三种不同的摇床中，培养0-55小时，每个五小时取出一组测量靛蓝含量。（5）取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量.2.2.5环境因素对发酵产靛蓝的影响（1）实验第一步需配置SD培养基，YPD培养基与20%葡萄糖溶液，注意在配置过程中调节SD培养基与YPD培养基的ph为6.5，同时葡萄糖需要单独分开灭菌，避免高温引起葡萄糖发生热变形[18]。（2）下午七点钟进行接菌；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备已灭菌的离心管，SD培养基，酿酒酵母BJ5464。操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。将镊子放在酒精灯外焰加热，进行灭菌。打开培养基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培养基中。借着取10mI的SD培养基放入离心管中。用镊子夹取枪头在平皿上划取菌落，放入到离心管中。将离心管放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养20h.（3）隔天下午三点钟进行扩大培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基和种子液，操作时关掉紫外灯，打开灯光与风机，点燃酒精灯。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分别按SD溶液体积1%接菌，吸取种子液加入到SD培养基中，将SD培养基放在(30℃，150r)的摇床中进行隔夜培养24h.（4）隔天下午三点进行5mI体系培养；安全柜打开紫外灯灭菌15分钟，准备SD培养基菌液，YPD培养基，离心管。每种温度及转速的摇床设置平行实验两组，做好标记。取2.5mISD培养菌液加入到离心管中，再取2.5mI的YPD培养基加入到离心管中，并加入适量的吲哚。将离心管分别放置在三种不同的摇床中，分别在避光条件下，自然光条件下，紫外光条件下，三组条件下发酵。（5）取出离心管，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，取出离心管，弃上清，用枪将液体吸取干净，加入300uI的DMSO溶液，用枪吹吸均匀，使菌落重新悬浮，对称放置在离心机中，(2000r；15min)进行离心，使用酶标仪OD650测量靛蓝含量.2.2.6靛蓝浓度的测定酶标仪法测定发酵液中靛蓝产量标准曲线的制作:将靛蓝标品用DMSO溶解定容成50.0μg/mL的标准溶液，然后依次稀释成1、2、4、8μg/mL的浓度梯度，用酶标仪测定650nm波长处吸光值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线:Y=0.9834X－0.0689，Ｒ2=0.9975。发酵培养基接入底物吲哚反应一段时间后，9000r/min离心20min，弃上清，沉淀物加入适量DMSO，再次离心10s后，用酶标仪测定650nm波长处吸光值，并根据标准曲线计算靛蓝浓度。发酵培养基接入底物色氨酸反应一段时间后，9000r/min离心20min，沉淀物加入适量DMSO，超声处理20min，待沉淀全部溶解后用酶标仪测定650nm波长处吸光值，并根据标准曲线计算靛蓝浓度。吲哚浓度的测定及转化率的计算标准曲线的制作准确称取吲哚标品，蒸馏水溶解定容成1M吲哚标准溶液，逐步稀释至1，2，4，8μg/mL，分别量取1mL与对二甲氨基苯甲醛（3g/L）9mL混合，沸水浴加热2min，滴加1滴2%亚硝酸钠，继续加热3min，用酶标仪测定650nm波长处吸光值，绘制标准曲线。发酵培养基接入底物吲哚反应一段时间后，9000r/min离心20min，取1mL上清液适当稀释与DMSO反应，测定650nm波长处吸光值，根据标准曲线计算色氨酸浓度。转化率/%=C0-CdC0×100式中：C0———起始发酵液色氨酸质量浓度（mg/mL）；Cd———终止发酵液色氨酸质量浓度（mg/mL）。第3章实验结果3.1外加色氨酸与吲哚实验3.1.1实验数据图3-1外加色氨酸对靛蓝产量的影响色氨酸浓度（mmol/L)5102040空白产量1（mg/L)0.052350.075240.039270.062160.03273产量2（mg/L)0.071970.100640.013110.078510.009884图3-2外加吲哚对靛蓝产量的影响吲哚浓度（mmol/L)1248空白产量1（mg/L)0.10140.902550.049080.075240.03273产量2（mg/L)0.13410.644220.039270.078510.009884其中空白组为不加色氨酸或不加吲哚的空白对照组3.1.2实验结果分析由实验数据初步看出当外加色氨酸时对酵母的靛蓝产量几乎没有影响，酵母的靛蓝产量增加量非常少，几乎可以忽略不计，可以初步认为酿酒酵母BJ5464菌株无法利用外源的色氨酸进行合成吲哚，即缺少利用外源色氨酸的酶，或者利用色氨酸的酶活性非常微弱。当外加吲哚时，可以看到当吲哚浓度为2mmol/L时，靛蓝的产量显著提高，并出现明显的阳性结果，可认为该菌株可以利用外源吲哚进行合成靛蓝。但当外源吲哚的含量较少时靛蓝的产量下降，且当吲哚的浓度提高时，靛蓝的产量明显下降，可推测是由于吲哚的含量较高，且吲哚具有毒性，抑制了酵母的生长。可看出外加色氨酸对合成靛蓝并无作用，且当外加吲哚的浓度为2mmol/L时，酵母自身可以利用外源吲哚进行合成靛蓝，显著提高靛蓝的产量。推测外加吲哚的最适浓度在2mml/L附近。3.2温度与摇床转速的影响3.2.1实验数据序号一二三产量1（mg/L)0.30240.87500.1024产量2（mg/L)0.20870.82410.1131图3-3不同温度及转速下的靛蓝产量一组，二组，三组分别对应（30℃，100r);(30℃，150r);(37℃，150r)三种摇床。3.2.2实验分析二组的靛蓝产量较于以前数据比较较为稳定，且产量最高。发现基因工程菌在37℃较于30℃条件下靛蓝的生成下降比较明显。不同温度条件下，发酵所产生的靛蓝色素溶液颜色变化速率呈显著性差异[11],，室温条件下靛蓝溶液色度变化缓慢，而37℃下色度变化速度明显加快，但后期变化较慢，具体原因仍待进一步确认[12].，在室温条件下靛蓝溶液色度变化缓慢，而37℃下色度变化速度明显加快，但后期变化慢，具体原因仍待进一步确认[13],，物质含量的变化情况与光照条件下检测结果相似，靛蓝的降解与靛红的生成同步发生，但其变化量无对应关系，可初步得出靛蓝降解产物包括靛红等多种成分[14]。发现酿酒酵母4℃下进行发酵时，靛蓝色素降解速率和靛红合成速率最低，在30h之前，随着温度的增加，发酵产靛蓝速率明显加快，而30h之后，室温条件下的反应速率明显高于37℃下反应速率，该结果与色度变化实验一致，具体原因仍待进一步确认。3.3PH对发酵产靛蓝的影响3.3.1实验数据图3-4PH与靛蓝产量的关系3.3.2数据分析发酵液起始pH对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响,试验研究了以吲哚为发酵底物、发酵液起始pH4.0～10.0时，pH对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响（图4）。发酵液起始pH对靛蓝色素合成代谢影响显著，先逐渐提高后下降的趋势呈现明显正态势分布；发酵液初始pH7.0时，靛蓝色素产量呈现最大值0.8mg/L左右；工程菌在发酵液起始pH过酸或过碱时都会明显降低靛蓝产量[15]，其原因可能与不适合菌体生长、抑制其合成代谢途径关键酶基因表达或关键酶酶活有关，不利于代谢产物靛蓝色素的积累[16]。3.4接种量对发酵产靛蓝的影响3.4.1数据分析图2-5接种量对靛蓝产量的的影响3.4.2数据分析接种量对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响图2-5表明，不同接种量对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响较小，在0.4%～2.0%时，靛蓝生成量总体趋势趋于平坦，这可能由于酿酒酵母在一定时间可达到较高菌体生物量，因此对靛蓝生成量影响不明显[17]，显示为靛蓝产量差异较小。3.5发酵时间对产靛蓝的影响3.5.1实验数据图2-6发酵时间对靛蓝产量的影响3.5.2数据分析发酵时间对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响图2-6显示,工程菌BJ5464发酵合成靛蓝色素与菌体生长曲线变化类似（适应期、对数期、稳定期和衰亡期），并有一定相关性，表明其酵母生长与靛蓝色素合成相伴产生，靛蓝色素可能属于初级代谢产物[19]。菌体在0～8h适应期阶段，不断消耗能源物质以供自身生长需要，其靛蓝合成代谢量极低[20]；在8～20h时靛蓝色素生成量迅速提高，呈对数式增加；在20～30h，靛蓝生成量稳定在380mg/L左右；30h以后靛蓝色素分解代谢增强，逐渐消耗降低[21].3.6环境因素对产靛蓝的影响3.6.1实验数据图2-7环境因素对产靛蓝的影响3.6.2数据分析不同光照条件下靛蓝色素溶液颜色和物质含量的变化前期研究发现，靛蓝色素溶液颜色随时间不断变化，由最初的蓝色最终变化为橘红色，该颜色与靛红溶液颜色接近［21－23］。为了揭示靛蓝色素溶液的变化规律，研究了不同光照条件下靛蓝色素溶液颜色随时间变化与初始靛蓝和靛红标准液颜色差异情况。结果如图4所示。随着时间增加，靛蓝色素溶液颜色与初始靛蓝标准液总色差不断增加，即呈现与靛蓝标准液颜色差异增加的趋势;而与初始靛红标准液总色差不断减小，即颜色上不断接近的趋势。上述结果从色差水平说明靛蓝色素溶液在变化过程中可能有靛红的生成，但因其与初始靛红标准液仍存在色差，说明可能有某种中间产物的存在。此外，不同光照条件下，呈现类似变化规律，但颜色变化速率明显不同，光照对靛蓝色素稳定性影响极显著(p＜0.01)。自然光条件下，颜色缓慢变化，紫外线照射能显著增加变化速率，避光处理能显著延缓颜色变化。为了进一步探究不同光照条件下靛蓝色素溶液色度变化的原因，利用高效液相色谱方法对靛蓝色素溶液中的靛蓝和靛红含量变化进行了检测。结果如图2-7所示。Z在自然光条件下发酵工程菌BJ5464进行产靛蓝反应，发现靛蓝色素含量缓慢降低，72h后发现靛蓝降解量达到初始含量的50%以上，同时可见靛红含量增加至靛蓝初始量的65%。而在紫外光照射下进行发酵时，可见靛蓝降解速率明显加快，6h后靛蓝含量几乎为0，而靛红含量为靛蓝初始量的16%;随着时间增加，靛红含量不断增多，72h靛红含量增加至靛蓝初始量的65%左右。在避光条件下进行发酵时，在72h后靛蓝含量几乎不变化且靛红基本不生成。上述结果表明靛蓝降解与靛红生成具有正相关性，但二者变化速率存在差异。根据靛红和靛蓝结构式可知，理论上一份子靛蓝可降解为两分子靛红，而上述变化量明显不符合上述规律，由此推测靛蓝降解产物组成复杂，靛红是主要产物，此外可能有其他中间产物生成。3.6结论通过基因工程技术，构建了高产靛蓝色素工程菌BJ5464，研究以吲哚为发酵底物时，环境因素条件对工程菌其发酵产靛蓝色素的影响，正交设计试验优化靛蓝色素生物合成条件[22]。结果表明，野生菌并无发酵转化色氨酸合成靛蓝色素的能力，构建的苯乙烯单加氧酶基因过表达工程菌株BJ5464，具有一定的靛蓝色素合成代谢能力[23]；光照对靛蓝色素稳定性影响极显著(p＜0.01)，自然光条件下，颜色缓慢变化。不同接种量对工程菌BJ5464发酵产靛蓝色素的影响较小，在0.4%～2.0%时，靛蓝生成量总体趋势趋于平坦，这可能由于酿酒酵母在一定时间可达到较高菌体生物量，因此对靛蓝生成量影响不明显[17]，显示为靛蓝产量差异较小。发酵液起始pH、发酵温度、发酵时间、底物质量浓度等因素条件对BJ5464的靛蓝色素合成代谢有一定影响[24]；正交设计试验优化的发酵条件为：起始pH6.5、吲哚质量浓度1M、发酵温度33℃、发酵时间38h，靛蓝产量达到0.9mg/L，与未优化时靛蓝最高产量0.34mg/L相比，正交试验优化使得靛蓝产量提高了近42.9%，接近理论值1.0mg/L；以色氨酸为发酵底物时，工程菌BJ5464转化合成靛蓝色素产量0.06mg/L左右，吲哚可能是工程菌BJ5464合成靛蓝色素更适宜的发酵底物[25]。该方面研究为生物转化靛蓝色素提供了理论支持和技术指导。 参考文献程雷，陈敏，孙宝国.pseudomonasputidaB4中靛蓝色素合成代谢调控机制研究[D].中国农业大学，2016任吉元,王文涛,李红.近期靛蓝生产工艺的研究进展[J].染料工业,1997,34(4):22-24程雷，陈敏，孙宝国.pseudomonasputidaB4中靛蓝色素合成代谢调控机制研究张华玲.靛蓝染料制备方法及染色工艺的发展[J].宁德师专学报(自然科学版),2010,22(4):364-367.贾秀玲.植物靛蓝染料染色及固色工艺研究[D].上海:东华大学，2012NICHOLSONSK，JOHNP.Themechanismofbacterialindigoreduction[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2005，68（1）：117-123.XIAOQimin，XUTianhong.ExpressionofflavinmonooxygenaseinEscherichiaColiandbiosynthesisofindigo[J].JiangsuScientificandTechnologicalInformation，2016（3）：78-80.（inChinese）NIEYao，FUMinjie，XUYan.Researchprogressconcerningoxygenasefromdifferentmicroorganismsandcatalyticreactionfeature[J].ChineseJournalofBioprocessEngineering，2013（1）：87-93.（inChinese）杜灵燕，张策，车逸心，刘雯娴，王孟菲，尹胜，王成涛.高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌的构建及靛蓝色素稳定性[J].食品科学技术学报,2017,（2）：16-38孙宝国，曹雁平，李健，等.食品科学研究前沿动态[J].食品科学技术学报，2014，（2）：1-11.马桥，曲媛媛，张旭旺，等.靛蓝的微生物合成研究新进展[J].应用与环境生物学报，2012，（2）：344-350.韩晓红，王伟，肖兴国.靛蓝及其同类色素的微生物生产与转化[J].生物工程学报，2008，（6）：921-926.JEUNJ，JUNGH，KIMJH，etal.Effectofthemonascuspigmentthreoninederivativeonregulationofthecholesterollevelinmice[J].FoodChemistry，2008，107（3）：1078-1085.HANGH，BANGSE，BABUBK，etal.Bio-indigoproductionintwodifferentfermentationsystemsusingrecombinantEscherichiacoli，cellsharboringaflavin-containingmonooxygenasegene（fmo）[J].JournalofBiotechnology，2010，150（3）：369-369.YOOM，KIMD，ZYLSTRAGJ，etal.Biphenylhydroxylationenhancedbyanengineeredo-xylenedioxygenasefromRhodococcussp.strainDK17[J].ResearchinMicrobiology，2011，162（7）：724.O'LEARYND，O'CONNORKE，DOBSONADW.Biochemistry，geneticsandphysiologyofmicrobialstyrenedegradation[J].FemsMicrobiologyReviews，2002，26（4）：403-417.BELTRAMETTIF，MARCONIAM，BESTETTIG，etal.Sequencingandfunctionalanalysisofstyr