蛋白质纯化技术

Isolation,PurificationandldentiticationofProtein2021/5/922021/5/9分子生物学圣经一分子克隆实验指南既我生物技术译从分子克隆

)南三版验指(第实MolecularA

LABORATORYIWIED

IDIIDNCloningMANUASambrook

and

Russell(关)1,禁姆有套光

D.W,

杜本年者黄墙室等i(上册)2021/5/9为什么要纯化蛋白质?蛋白质是生命功能的执行者·理论意义：

深入研究某种蛋白质的功能

以及作用机制，如信号通路中的蛋白·应用价值蛋白质工程医药、工业、科研..作为药物靶点...质蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性·

首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，

研究其结构与功能；·其次，

对蛋白质进行修饰改造时需要单

一的蛋白质作为原材料；·最后，为了生产性能更优良的蛋白质，

需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯

化，从而开发出相关产品。本章概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则

·纯化步骤蛋白质的鉴定2021/5/9562021/5/9一、蛋白纯化方法·蛋白质纯化的根据：不同的蛋白质，理化性质不同。·理化性质不同的原因：氨基酸的数目和序列不同。72021/5/91.

与蛋白质分离纯化相关的理化特性·①分子大小②

分子形状③

带电特性·④溶解特性·⑤与配体特异性结合不同·⑥吸附性质·⑦变性和复性81.1分子大小

·蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质肽链的数目每条肽链的氨基酸残基数目。几百~百万

Da·常用方法透析超滤凝胶过滤2021/5/9。离心92021/5/9透

析(dialysis)利用透析袋把大

分子蛋白质与小

分子化合物分开

的方法。At

start

ofdialysisAt

equilibriumcontaining

protein

solutionMagneticstirrer

for

mixingSemipermeable

bag2021/5/910112021/5/9超

滤

法应用正压或离心力蛋白质溶液

使蛋白质溶液透过有一定截留分子量支持膜的栅板

的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目超滤液

的。加压半透膜122021/5/9超

滤

法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓

缩蛋白质溶液的目

的。2021/5/9>凝胶过滤是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。凝胶过滤分离蛋白质a.大球是葡聚糖凝胶颗粒b.样品上柱后，小分子进入凝胶微孔，大分

子不能进入，故洗脱时大分子先洗脱下来142021/5/9小分子蛋白质大分子蛋白质c.小分子后洗脱出来葡聚糖凝胶15·超速离心

①离

心

(centrifugation):

利用机械的快速

旋转所产生的离心力，将不同密度的物

质分离开来的方法。①超

速离心法(ultracentrifugation):~60

万

g

,

6万~8万

r/min。

可用来测定蛋白质分子量。2021/5/9162021/5/9·超速离心Optima

L-XP171.2分子形状

·形状蛋

白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝

胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受

到分子形状的影响。·方法梯度离心。电泳2021/5/9181.3电荷

·原理蛋白质的净电荷与蛋白质等电点pI

以

及环境pH值有关

(pH>pI,

一

)·方法电泳离子交换层析2021/5/9A280a.样品全部交换并吸附到树脂上b.

负电荷较少的分子用较稀的Cl或其他负离子溶液洗脱c.电荷多的分子随

CI浓度增加依次洗脱d.

洗脱图A280

表示为280nm

的吸光度d离子交换层析分离蛋白质二禁二〔Cl-〕19bCa蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团

不同，因此在溶剂中的溶解度不同。通

过改变

pH

、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。·方法：沉淀法盐析法

(eg.

硫酸铵)。有机溶剂沉淀法

(eg.

丙酮)等电点沉淀法1.4溶解度·原理202021/5/921·盐析法

·蛋

白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，

称为盐析。·盐析原理：高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化

膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而

引

起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质

的变性。2021/5/9生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识

别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结

合能力称为亲和力。·方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。·分类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析1.5配体特异性结合·原理222021/5/9232021/5/91.6吸附性质·原理蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、

陶瓷、塑料等。·方

法。疏水层析242021/5/91.7变性和复性·原理变性：

蛋白质在一定的理化条件下会失去原有

的空间结构、生物学功能及部分理化特性。复

性

：当

变性条件去除后恢复原有的空间结构

及生物学功能。·方法如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中

纯化原核表达蛋白252021/5/92.分离方法在实验操作上，分为：沉淀法离心法·电泳法·超滤法相分配法·层析法分高方法方法的基础分离方法方法的基础汽

定

法层

析

法硫酸铵溶解度离子交换层析电荷，电荷分布丙酮溶解度疏水作用层析疏水性聚乙烯亚胺电荷，大小反相HPLC疏水性，大小等电点溶解度，p!亲和层析配体结合位点相分配法(如，用聚乙二尊)溶解度DNA亲和层析DNA结合位点电

泳

法外源凝集素亲和层析情基内容与神类疑胶电泳电荷、大小，形状固定化金属亲和层析金属结合能力等电葵集电泳pl免疫亲和层析特异抗原位点离

心

法大小，形状，密度层析聚焦pI帮

滤

法大小，形状凝胶过滤层析大小，形状2627·Note

*不可能有一套统一的方法适用于分离纯

化所有的蛋白质，*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分

离纯化程序，*而且所用的主要技术手段都基本相同。2021/5/9282021/5/9二

、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤·总原则·以合理的效率、速度、收率和纯度，

·将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，·同时仍保留其生物学活性和化学完整

性。29二、

蛋白质纯化的总原则和纯化步骤·步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定302021/5/9>

蛋白质纯化的前期准备·关于蛋白质我们已知什么?·最好的来源?·蛋白质纯度要求?活性要求?·纯化蛋白的量?·如何进行鉴定?·纯化时间长短?·最终花费?·纯化方案?1

、

选择实验材料及预处理

·选择实验材料物种的选择□

组织的选择·实验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水一蒸馏水一提取缓冲液材料破碎：2021/5/9·材料破碎·机械剪碎

·研磨·反复冻融法

·超声破碎法

·高压匀浆法

·酶解法322021/5/9332021/5/92、

蛋白质的提取·①提取分离原则。尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失

(温度过高、

pH

、有机试剂、金属

离子、蛋白酶等因素)选择合适的pH、

选择合适的离子强度·②提取液成分的确定pH

缓冲液：

Tris-HCl,

Tris-Gly,

Gly-HCl,

柠檬酸-柠檬酸钠...。离子：

动物

NaCl,

植物KCl还

原

剂

：DTT...。蛋白酶抑制剂：

EDTA,

PMSF...金属离子螯合剂：

EDTA,EGTA...去污剂：SDS,CHAPS,

Triton

X-100,Tween-20甘油·③温度0~4℃2、

蛋白质的提取342021/5/9352021/5/93

、蛋白质的粗分级(粗提)·

使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，

采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。·常用的实验技术：

沉淀法(盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀)、超速离心、透析、

超滤...362021/5/94、

蛋白质的细分级·粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离

纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大

小、分子形状、分子表面特征或分子带电

状况进一步纯化。·常用的实验技术：

层析374.1.层析

(chromatography)

流动相：缓冲液2021/5/9

nary

C

Detection

of

separated

proteinseophasStati固定相：凝胶原理：Stationary

phase·凝胶介质PharmaciaSephadex

Sepharose

Sephacryl

SephacelBio-RadBioGelABioGel

Pglucose(dextrose)agaroseglucose+

acrylamidecelluloseagaroseacrylamide382021/5/9392021/5/9·层

析

装

置

(Chromatographic

equipment)蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器SolventreservoirFractioncollector◎o华

GISDN

'MNPULS3402021/5/9412021/5/9422021/5/94.1.层析

(chromatography)·分子筛层析

(Gel

filtration)·离子交换层析

(Ion

exchange)·

疏水作用层析

(Hydrophobic

interaction)·亲和层析

(Affinity)432021/5/94

.1.1

分子筛层析

(Gel

filtration)·原理也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝

胶材

料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，

分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同

而先后流出，从而达到分离纯化的目的。·凝胶介质。葡聚糖

(glucose)琼

脂

糖

(agarose)聚丙烯酰胺

(acrylamide)纤

维

素

(cellulose)·分子筛层析Gel

filtration

chromatography·亲水·对蛋白质亲和力低

·物理化学性质稳定

·流速稳定HydrophilicNo

spontaneous

binding

to

proteins.

Chemically

and

physically

stableRigid

to

allow

a

high

linear

flow-rate442021/5/9·分子筛层析Gel

filtration

chromatographySample

is

washedthroughSample

isapplied2021/5/945·分子筛层析Gel

filtration

chromatographyMixture

of3

proteinsPorousbeads2021/5/9·分子筛层析Gel

filtration

chromatographyfractionVolume

eluted472021/5/9Amount

o

l

protein·原理。在一定的pH

条件下，不同的蛋白质带有

的电荷的种类和数量不同，因此它们与带

电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别

，

把蛋白质分开的层析方法。482021/5/9exchange)4.

1.2

离

子

交

换

层

析

(lon494

.

1

.

2

离

子

交

换

层

析

(lon

exc

h

ge)·种类。阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷·介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖...带电基团：

羧甲基一带负电；二乙基

氨基—带正电平衡离子：负电基团：

H+或Na+正电基团：

OH

或Cl20an21/5/9502021/5/9·

离子交换层析

(lon

exchange)阳离子交换：阴离子先，

阳离子后阴离子交换：阳离子先，

阴离子后Mixture

of+

and-chargedproteinsBeads

of.+chargedDEAE-celluloseAmount

of

proteinCopyright

1999

Jzhn

Wiey

and

Sona

inc

Angrs

erved512021/5/94.

1.3亲和层析

(Affinity

chromatography)·原理利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特

性而分离蛋白质的一种层析方法。将配体固定于支持物上，当混合样品流过

此支持物时，

只有目标蛋白能与配体专一

性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改

变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。52·

亲和层析

(Affinity

chromatograph

1)/5/9Protein

to

be

purified(e.g.,

insulin

receptor)

Ligandy202Mixture

ofproteinsought

(二)andcontaminant

(4)Copyright

1909

Jzhn

Wiey

and

Song

ine

Angrs

ervod(a)(b)53·

His-

亲合示意图(金属螯合层析)ü

镍

柱

(Ni-NTA)

imidazoleHisNi

HisHisProteinelutionMetal

Chelate

Affinity

ChromatographyC-COOH-O-C-C-C-O-C-C-C-NOH

OH

C-COOHPBT

expression

system固相载体4.1.4疏水作用层析·原理蛋白质表面疏水基团与介质疏

水配体的可逆相互作用·方法高离子强度下待分离的样品吸

附在疏水介质上，然后降低离

子强度选择性将样品解吸，

疏

水弱的物质先洗脱，疏水强的

物质后洗脱。2021/5/9554.2.电泳

(Electrophoresis)

·电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其

电性相反的电极移动。

Samples

placed

from2021/5/9Glass

plates

with

gel

between

themLower

buffer

tankTop

buffer

tankpipette

into

wells562021/5/9·蛋白质常用电泳技术·聚丙烯酰胺凝胶电泳

(PAGE)·SDS-

聚丙烯酰胺凝胶电泳

(SDS)·等电聚焦电泳

(Isoelectric

focusing-IEF)·

双

向

电

泳

(Two

Dimensional

Electrophoresis

)572021/5/94.2.1

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳·

SDS:·1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异·2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异Myosinβ-Galactosidase

Phosphorylaseb

Bovine

serum

albuminOvalbuminCarbonic

anhydraseSoybean

trypsin

inhibitor

Lysozyme·

电泳法测目标蛋白的分子量200,000116,25097,40066,20045,00031,00021,50014,400582021/5/9M

Unknownstandards

proteinRelative

migrationlo

g

M,(a)(b)21·原理。电荷效应。浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应分子筛效应Lower

buffer

tank2021/5/94

.2.2不连续PAGE

分离蛋白质的原理·在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小

和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。Samples

placed

frompipette

intowells602021/5/94.2.3等电聚焦电泳

(lsoelectric

focusing-IEF)Isoelectric

FocusingpH

GradientC

a

th

o

d

e

-An

o

d

e

tgradient

isestablished

inthe

gel

afterapplication

ofan

electricProteinsolution

is

added

and

electric

fieldisreapplied.After

staining,

proteins

areshown

to

bedistributed

alongpH

gradientaccording

totheir

pIvalues.612021/5/9·

等电聚焦

(Isoelectric

focusing)An

ampholytesolution

isincorporatedinto

a

gel.field.622021/5/94.2.4双向电泳·第一

向：等电聚焦

(pI)·第二向：

SDS(MW)·

双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多

肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。632021/5/9②SDS

gel

electrophoresis①Isoelectric

focusingSecond

dimensionSDS

polyacrylamide

gel

electrophoresisIsoelectric

focusinggel

is

placed

on

SDSpolyacrylamide

gel.Isoelectric

focusing

gel

is

placed

on

SDS

polyacrylamide

gel.0》))))))First

dimensionIsoelectric0刀))))))Decreasing

plDecreasing

MrfocusingDecreasing

→→pl642021/5/9Two

Dimensional

Electrophoresis

of

E.coli

Proteins-more

than

2,000

proteins

were

visualized蛋白质纯化策略方案设计篇Protein

purification

strategy652021/5/9purity

,

activity

and

quantity·

充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性·to

simplify

technique

selection

and

optimisation·确定活性测定方法·fast

detection

of

protein

activity/recovery

and

criti

calcontaminants·尽量减少纯化步骤extra

steps

reduce

yield

and

increase

time,

combine

steps

logically三、

纯化方案设计原则确定纯化目标2021/5/9Extremely

high>99%Therapeutic

use,

in

vivostudiesHigh

95-

99

%X-ray

crystallography

and

characterisation

methodsmost

physico-chemical672021/5/9·确定纯化目标Purity

requirement

examples

are

shownbelow.Antigen

for

antibody

production

N-terminal

sequencingModerate

<

95

%68三、

纯化方案设计原则

·确定目标purity,

activity

and

quantity·

充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to

simplify

technique

selection

and

optimisation·确定活性测定方法·fast

detection

of

protein

activity/recovery

and

criti

cal

contaminants·

尽量减少纯化步骤extra

steps

reduce

yield

and

increase

time,

combine

steps

logically2021/5/9·purity,

activity

and

quantity·

充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to

simplify

technique

selection

and

optimisation·确定活性测定方法fast

detection

of

protein

activity/recovery

andcriticalcontaminants·尽量减少纯化步骤extra

steps

reduce

yield

and

increase

time,

combinesteps

logically三、

纯化方案设计原则·确定目标2021/5/970·

确定活性检测方法

·严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质，来

设计活性检测方案·常见检测方法：酶学检测

enzymatic

assays.配体检测

ligand-binding

assays免疫检测

immunological

assays活性测定方法的要求：快速、简便、

特异和定量2021/5/9·purity,

activity

and

quantity·

充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性·to

simplify

technique

selection

and

optimisation·确定活性测定方法·fast

detection

of

protein

activity/recovery

and

crit

icalcontaminants·尽量减少纯化步骤extr

a

steps

reduce

yield

and

increase

time,

combine

steps

logically三、

纯化方案设计原则·确定目标2021/5/972·尽量减少纯化步骤

2021/5/9Fig.

1.Yields

from

multi-step

purifications.ü纯化步骤越多，样品损失越大(产量、活性)73·

尽量减少纯化步骤

KEEP

IT

SIMPLE!·减少每步操作时间o

to

avoid

lengthy

procedures

which

risk

losing

activity/reducingrecovery·减少添加物o

additives

may

need

to

be

removed

in

an

extra

purification

step

or

may

interfere

with

a