体细胞核移植重编程

体细胞核移植重编程王心、技术简介 技术名称：体细胞核移植重编程 名词解释：诱导已分化体细胞发生去分化，使之成为一种具有胚胎干细胞特征的多能状态的过程。[1]不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞命运。 技术特点：避免异体移植产生的免疫排斥反应。 相关技术：体细胞核移植、细胞融合等。 分类：目前重编程主要指两个过程：分化的细胞逆转恢复到全能性状态的过程；从一种分化细胞转化为另一种分化细胞的过程。二、引入2017年末，克隆猴“中中”和“华华”的诞生意味着与人类最相近的灵长类动物的体细胞克隆成为了可能。此前，灵长类动物的克隆一直是技术难题之一。 回顾克隆技术发展史，克隆羊“多利”的降生，证明了哺乳动物可以被克隆，此后，小鼠，猪，牛，马……多种动物都被成功克隆，然而克隆猴却遇到瓶颈。二、背景 1962年，英国科学家约翰·戈登通过克隆青蛙实验证实：细胞核具备发育个体所需的遗传信息，他用成熟肠细胞的细胞核替换了青蛙卵细胞的细胞核，发育为性成熟的成体青蛙。[2]由此，我们得知卵细胞质能重编程体细胞核，即分化细胞的细胞核在移植进入卵母细胞质中后，能够指导卵细胞发育。[3]1998年，Wilmut等在哺乳动物中完成体细胞核移植，获得克隆羊“多利”，证实哺乳动物的卵细胞中具备将体细胞核重编程的条件。2001年，Tada的实验表明：除却卵细胞质，胚胎干细胞质在核移植细胞融合后也能重编程体细胞核。2006年，日本科学家山中伸弥用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM)4个转录因子就可以把小鼠胚胎成纤维细胞重编程到多能性状态。[2]三、技术原理卵细胞的重编程机制[4]：卵子有重编程已经定向分化了的精子细胞核的能力，相关研究利用卵母细胞探索卵细胞的重编程机制：许多移植进卵母细胞生殖泡的哺乳动物体细胞核被直接重编程而表达干细胞标志基因，包括Oct4,Nanog和Sox2。在卵母细胞内进行的细胞核重编程不会产生新的细胞与这个重编程伴随而生的机制包括：异染色体的开放；分化标记，如DNA甲基化的去除；组蛋白修饰以及组蛋白交换……。（机制发生的基础是，受精卵拥有能引起上述效应的高浓度特定蛋白。）如果卵子的蛋白能够在几秒或几分钟的时间内被交换到移植进来的体细胞核的话，那么完全重编程就应该总会发生。但实际并非如此，可能的原因是移植进来的细胞核携带了供体细胞的表观遗传学记忆。其中组蛋白H3.3的表达被认为能阻碍重编程的发生，并且会保留以前基因表达的记忆。表观遗传修饰的重编程过程： 解释：供体细胞核移入去核的卵母细胞后,供体核停止本身的基因表达程序,恢复为胚胎发育所必需的全能性状态。 体细胞核移植在重编程过程中最重要的是DNA甲基化和组蛋白乙酰化,它们属于染色体的改变,是可遗传的非基因序列发生变化,即表观遗传学改变。大部分分化细胞中的基因表达调控就是通过这些基因修饰来进行的。 在此，先就DNA甲基化和组蛋白乙酰化的相关原理作出简要阐释：DNA甲基化[1] 作用：甲基化为蛋白质和核酸的一种重要修饰方式。 可以调节基因的表达和关闭。 DNA甲基转移酶能将S一腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团转移到CpGs的胞嘧啶残基上,使CpG岛二核苷酸的胞嘧啶变为5一甲基胞嘧啶,这种化学反应称为DNA甲基化。 自然状态下,哺乳动物成熟的生殖细胞基因组处于高度甲基化状态。受精后数小时内,精子基因组发生快速、主动去甲基化,卵母细胞因在卵裂过程中依赖于DNA的复制,其基因组发生被动地、滞后地去甲基化。到达囊胚阶段时,胚胎基因组甲基化水平降到最低。之后在从头甲基化酶的作用下,附植前后的胚胎重新开始新的甲基化过程。 相关研究表明，体细胞克隆胚胎出现体外受精胚胎类似的去甲基化趋势，但同时期的甲基化水平较高。在体细胞核移植过程中,供体细胞在移入去核的卵母细胞后,需要在很短的时间内完成重编程过程。但作为供体细胞的体细胞通常具有较高的甲基化水平,因此常发生不完全重编程过程。重构胚无法辨别供体细胞去甲基化效率低下的甲基化模式,使得重构胚基因组很多位点出现异常基化。 解决途径：在DNA复制过程中,人为加入的DNA甲基转移酶抑制剂与DNA甲基转移酶形成共价化合物,抑制DNA甲基转移酶的活性,降低基因组甲基化水平。组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化与转录活化有关。 细胞的乙酰化和去乙酰化过程由组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白乙酰化酶(HAT)调控。 HDACs能够使组蛋白去乙酰化,之后带正电的组蛋白部分与带负电的DNA紧密结合,致使染色质发生致密卷曲成为阻抑结构,最终抑制基因转录。 相反,HATs通过在组蛋白N端赖氨酸残基上引入疏水的乙酰基使组蛋白乙酰化,增大DNA与组蛋白间的静电引力和空间位阻,导致二者间的相互作用减弱,DNA易于解聚,染色质呈转录活性结构状态,利于转录因子与DNA模板相结合,最终激活基因转录。 体细胞核移植重构胚不能像体外受精胚胎那样使染色质解聚,这就使组蛋白易发生异常的乙酰化。在重编程过程中,通过抑制卵胞质中特定的HDAC或者重编程过程中的一个因素,供体细胞核就有可能重编程的更正确。四、克隆实例克隆猴： 问题： 灵长类的克隆之所以艰难，很大程度取决于灵长类动物的卵极为敏感(简单的挤压也会导致其异常分裂)且灵长类的细胞核非常“恋旧”(重编程不彻底，无法指挥胚胎发育)。 解决途径： 华裔科学家张毅博士发现细胞核“恋旧”的本质在于其表观遗传学修饰——细胞DNA上一些特殊的化学标记。如果在克隆的过程中加入一种叫做Kdm4d的酶，就可以“擦掉”体细胞核基因的一些关键的表观遗传修饰。五、技术优缺点：利：1).就“克隆猴”一例：基因编辑非人灵长类成为可能。猴子与人类亲缘关系很近，猴子也会出现类似于人类的疾病，可以利用基因编辑与克隆技术迅速制作出相关的猴模型。借助这样的动物模型科学家可以在与人类更加相似的平台上研究疾病的发病机制，试验新的治疗方法。2).体细胞重编程技术的建立为临床治疗某些特殊疾病提供了很好的技术突破。如需求量大的器官移植，可以借助体细胞重编程来获得患者自身遗传背景来源的干细胞，再通过合适方法诱导分化成特殊细胞类型或器官，以达到治疗的目的。[2]弊：1).就ips细胞一例：iPS细胞中存在的病毒插入基因具有致癌性。对于这个过程我们仍然知之甚少，选取的病毒载体的情况我们仍无法确切界定。因此，在消除这些不确定因素的路上，我们还需要继续努力，才能放心应用。2).克隆技术带来的伦理问题。3).通过克隆产生的个体具有完全相同的遗传基因，变异减少，对疾病的敏感性相同，一种疾病的到来可能毁灭的是整个群体。参考文献：[1]曹慧，苏文龙等,哺乳动物体细胞核移植重编程研究进展因组学与应用生物学,2016,35(1):100—106[2]李东伟,陈捷凯,裴端卿,诱导重编程的表观遗传调控研究进展,

生命科学,2017,29(10):1000-1006[3]细胞核重编程：从克