干细胞睾丸生精小管移植的模型研究

干细胞睾丸生精小管移植的模型研究

据统计，世界上80000名妇女遭受了怀孕和不育，其中50%是由丈夫引起的。卵细胞胞质内单精子注射技术(ICSI)的建立与睾丸显微取精技术的逐步发展,使某些原发性无精子症(又称非梗阻性无精子症,NOA)患者有了生育子代的可能。但是对于大多数NOA患者而言,用自己的精子生育出健康的子代仍然只是一个美好的愿望。自从1994年Brinster和他的同事建立了小鼠睾丸生精细胞移植技术以来,该技术已成为众多科研人员用来研究精子发生机制这一复杂过程的有力工具。1995年Jiang等报道了大鼠个体之间成功的精原干细胞移植,随后小鼠和大鼠之间的移植也相继获得成功。直至2006年Nayernia等用该技术获得的胚胎干细胞来源的雄性配子成功地生育出子代小鼠,这些成果无一不与移植技术的建立有着密不可分的关系。要想获得移植的成功,移植受体模型的建立和移植方法改进是两个非常关键的因素。关于移植受体模型的建立,目前已经有很多方法:化疗法、放疗法、转基因法、外科手术法、激素法等,这些方法中有的比较复杂昂贵,有的不稳定。本实验主要通过不同剂量的白消安(Busulfan)腹腔单次注射的方法探索无精子症小鼠模型的建立。关于生精小管干细胞移植的方法与技术,一般参照Ogawa等于1997年所建立的一套系统。我们对注射装置进行了自主设计和技术改进,并申报专利。本课题试图建立简单易学、适于推广的移植技术,为干细胞向雄性配子发育的研究奠定基础。1材料和方法1.1干预移植受体模型的构建1.1.1材料表面1.1.1.物中心物中心清洁型雄性ICR小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)共60只,6～8周龄,分为A、B、C、D4组,每组15只。动物饲养及使用按照上海交通大学医学院实验动物中心实验动物伦理委员会规定执行。1.1.1.2试剂白消安(Sigma产品),生理盐水,二甲亚砜(DMSO,Sigma产品)。1.1.2方法1.1.2.冰冰冰用DMSO将白消安配制成25mg/ml的贮存液保存于-80℃冰箱备用。配制工作液时先用生理盐水将DMSO稀释为50%,再用此50%的DMSO将贮存液稀释为5mg/ml的工作液,置于37℃水浴中防止其凝固。1.1.2.体重和注射d组腹腔单次注射上述工作液,A组剂量为15mg/kg体重,B组剂量为30mg/kg体重,C组剂量为40mg/kg体重,D组为对照组,注射等体积的50%DMSO。注射后常规饲养,每日观察小鼠的存活情况。1.1.2.睾丸生精细胞中空率的检测分别于注射后4、8、12周各取上述4组小鼠每次5只处死,取出双侧睾丸称重,然后将其放入Bouin液固定,常规石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红(HE)染色,普通光学显微镜下观察睾丸生精上皮的改变,统计生精小管的中空率,每张切片计数30～100个生精小管,没有各级生精细胞的生精小管视为中空。1.2干预移植方法的改进1.2.1材料表面普通50ml注射器2个,三通管2个,橡胶管、阀门、口含器各1个,旋钮式微量注射器1个,1mm直径的玻璃穿刺针1根。1.2.2方法1.2.2.1各种组件的连接如图1所示。1.2.2.空气进入接口系数d①关闭F,用A1抽吸细胞悬液到穿刺针上所需刻度;②打开F,边穿刺边通过E试探性地注射,一旦发现有液体进入生精小管即关闭F;③此时可先用A1注射(液体较多时),或者直接转动D用A2注射(视具体情况而定),但当临近液体注射完时一定要用A2注射,防止过快造成空气进入;④注射完毕。2结果2.1白色消毒对大鼠生存的影响白消安处理后的第16天,C组有1只小鼠死亡,其后各组小鼠均未出现死亡。各组之间小鼠死亡率无显著性差异(P>0.05)。2.2两组12周时f、c、p之间的关系见图2。白消安处理后4、8周,B、C组小鼠的平均睾丸重量显著低于D组(P<0.05),12周时与D组差异不大(P>0.05),而B、C两组之间无显著性差异(P>0.05)。A组只是在4周时小鼠睾丸重量显著低于D组(P<0.05),而8和12周时小鼠睾丸重量与D组相比均无显著性差异(P>0.05)。2.3多层生精细胞的生长白消安处理后4、8周时C组的生精小管中空率分别为80.45%、67.33%,显著高于其他各组(P<0.05);B组4、8周的中空率也都在50%以上,显著高于A组(P<0.05)。A组在整个处理过程中生精小管的结构改变不大,只是在4周时有少部分生精小管中空,8、12周时已经基本恢复到正常状态;B组在4周时生精小管均大面积中空,各级生精细胞消失,只能见到少量的精原细胞,8周时已有部分生精小管可见多层生精细胞,但精子细胞未见;C组在4、8周时的情况与B组相似但更加严重,可以看到有些管腔结构紊乱、塌陷;D组一直可见各级生精细胞。见图3。2.4双侧睾丸的注射将消化后的干细胞制备成1～3×107/ml的细胞悬液,用改进后的注射装置经输出小管进行注射,成功率可达90%以上,再加上细胞损失较少,注射双侧睾丸(注射面积60%以上)仅需细胞悬液50μl左右,并且注射速度较快,一侧睾丸10min左右即可完成。本设计已申请实用新型专利,申请号:200920066863.3(见图4)。3小鼠干细胞移植实验干细胞是一种能够不断地进行自我增殖和具有多向分化能力的细胞,这种细胞是科学家未来用于治疗许多疾病的希望,也是生殖医学家们用来治疗难治性不育症的愿望。目前诱导干细胞向精子分化主要有两条途径:体外诱导和体内诱导。体外诱导难度较大,且体外易受到各种因素的干扰,稳定性较差;而体内诱导是将生精干细胞移植到睾丸内,使这些干细胞在精子发生的天然微环境内向精子分化,这无疑比体外诱导有更大的优越性。为了提高生精干细胞移植的成功率,理论上认为先需要清除内源性的干细胞,为植入的干细胞提供一个稳定的内环境(niche)。虽然目前建立这种移植受体模型的方法有多种,但是用的最多、相对简单的方法还是白消安腹腔单次注射法。由于运用此方法时,不同的动物品系与不同的注射剂量所得到的结果不同,动物的死亡情况也不同,所以本实验的主要目的就是要摸索出一个适合本实验的小鼠品系及给药方法,以获得一个稳定可靠的移植受体模型。从实验结果看,A组虽然在4周时睾丸重量变化较D组明显,但生精小管上皮结构的变化不能满足作为移植受体模型的需要,尽管在4周时相当比例的生精小管中空,但是比例较小,且维持时间较短,8周时已恢复到接近正常的状态,所以15mg/kg体重的剂量不能满足模型的需要。B、C两组在4、8周时的睾丸重量均有显著的减轻,而这与此时两组的生精小管中空率(均在50%以上)以及光镜下看到的上皮结构也是吻合的,说明此时睾丸内的精子发生受到影响,内源性的精子发生处于抑制阶段。而此后12周时内源性的精子发生逐渐恢复,说明该无精子症的模型是可逆的。同时也应当看到,所有组别的小鼠中只有C组出现1只死亡,并且4周时的石蜡切片除了可以看到大面积中空的生精小管外,还有很多生精小管管腔结构紊乱,甚至塌陷,说明40mg/kg体重的剂量对该品系小鼠有较大的毒性,对睾丸的生精功能损害较大,不利于干细胞在生精小管内存活及向雄性配子的分化。综上所述,我们推荐30mg/kg体重剂量的白消安单次注射于ICR小鼠的腹腔内,4周后所得的精子发生障碍模型是可靠的,适合作为生精干细胞移植的模型。改进后的干细胞移植方法主要有以下优点:①由于采用边穿刺边从口含器端试探性地进行注射的方法,从而使注射的成功率达90%以上,减少了细胞的浪费,注射双侧睾丸仅需约50μl细胞悬液即可使面积达60%以上;②口含器端注射成功后即用注射器加压注射,与单纯口吹法相比缩短了注射时间,减少了操作人员体力的浪费,并且可以使注射面积的选择范围更大(0～100%);③可使用注射器A抽吸液体,这样省时