南开大学仪器分析课件-第十二章 高效液相色谱分析法

第十二章高效液相色谱分析法

(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）第一节概述一、HPLC的特点1、

高压：液相色谱法使用液体作为流动相(简称载液)，液体流过色谱柱时，所遇到的阻力很大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压150-350×105Pa。2、高速：高效液相色谱法的分析时间较经典的液相色谱所需的时间要少得多，分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。3、

高效：一般气相色谱法的塔板数是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。4、

高灵敏度:紫外光度检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的灵敏度可达10－11g。二.HPLC与GC的比较1.分析对象不同

GC:20%有机物总数(气体、沸点较低的、热稳定的化合物）

HPLC：80%有机物总数（高沸点、热稳定性差）2.流动相不同

GC：仅起运载作用

HPLC：除具有运载作用外,还与组分产生亲和力（增加了一个控制和改进分离条件的参数）3.操作条件不同

GC：较高温度

HPLC：室温下进行（设备费用高）第二节HPLC的理论基础一、范第姆特方程式：H=A+B/u+C·u1.涡流扩散项－AA=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，n↑,柱效↑

。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

2.纵向扩散项（B/u)

B/u=2γDm/u

γ—弯曲因子

Dm—组分分子在流动相中的扩散系数

Dm很小，只要流速u不是太低（不小于0.5cm/s

），

B/u项可忽略3.传质阻力项

液—液分配色谱

Cu=Cmu+Csu

Cmu—流动相传质阻力项

Csu—固定相传质阻力项Cmu=(ωmdp2/Dm+ωsmdp2/Dm）u（包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力）

Dm—组分在流动相中的扩散系数

ωm—柱和填充性质决定的因子（柱系数）

ωsm

—与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。

dp—固定相粒度Csu=(ωsdf

2/Ds)u

Ds—组分在固定相（液）的扩散系数

ωs—与容量因子k有关的系数

df—固定相液膜的厚度

综合式：H=2λdp+

2γDm/u+(ωmdp2/Dm+ωsmdp2/Dm+ωsdf2/Ds）u第三节高效液相色谱仪贮液罐高压泵

进样器

检测器记录仪色谱柱温度控制梯度洗脱装置液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（4）一、高压输液系统

1.贮液罐:

用来贮存作为流动相的各种溶剂

2.高压输液泵（核心）：使流动相较快的通过色谱柱(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性

3.梯度洗脱装置：相当于气相色谱中的程序升温，在样品分离过程中按一定的程序通过改变流动相中两种（或两种以上）溶剂的比例来调整流动相的极性、离子强度、pH值外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。二.进样系统

1.隔膜注射进样器

2.高压进样阀

三.分离系统——

色谱柱

不锈钢制成，内壁抛光，长度5-30cmid:4-5mm四.检测系统检测器应具有：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。

可用的检测器有：紫外、荧光、折光、电化学、质谱等

常用的检测器有：紫外-可见光度检测器和示差折光检测器1.紫外-可见光度检测器（包括固定波长型和可调波长型）固定波长型：常采用汞灯的254nm或280nm谱线可调波长型：光电二极管阵列检测器（photodiodearraydetector,PAD)光电二极管阵列检测器：

2048个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

紫外-可见光度检测器灵敏度很高，检测限可达10-9g·mL-1（1）优点：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度洗提（2）缺点：不能用于对紫外-可见光完全不吸收的试样的检测2.示差折光检测器

一种浓度型检测器，是通过连续测定测量池中溶液折射率的变化来测定组分的浓度。（1）优点：凡与流动相折射率不同的组分，都可以用示差折光检测器来检测，所以示差折光检测器是一种通用型检测器。示差折光检测器的灵敏度可达10-7g·mL-1。（2）缺点：对温度的波动很敏感，并且不能用于梯度淋洗。第四节HPLC的固定相和流动相一、固定相

固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。1.表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。表面活性材料为硅胶的固定相，如国外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；表面活性材料为聚酰胺的固定相，如Pellion。

这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。2．全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的LichrosorbALOXT。这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.

二.流动相

HPLC流动相是液体，除具有运载作用外，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。

溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。

（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～1OOnm。

（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

（6）毒性小，安全性好。第五节HPLC的主要类型及选择一、液—液分配色谱（LLPC)（一）分离原理：与液—液萃取相同，根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。（二）固定相

固定液：β，β’-氧二丙腈强极性聚乙二醇中极性角鲨烷非极性（三）流动相1.对流动相要求：尽可能不与固定相互溶，且与固定相的极性差别越显著越好。2.流动相和固定相的极性程度

正相分配色谱：流动相极性<固定相反相分配色谱：流动相极性>固定相二、液—固吸附色谱法(LSAC)

根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。（一）、分离原理Kad=X—试样分子S—流动相溶剂分子Kad↑→组分在吸附剂上保留强，难洗脱Kad↓→组分在吸附剂上保留弱，易洗脱(二)固定相吸附强弱不等的吸附剂,如:硅胶(适宜对脂肪胺、芳香胺分离）、氧化铝（芳香烃异构体分离）、聚酰胺等表面多孔型、全多孔型都可作吸附色谱中的固定相（三）流动相对极性大的试样宜采用极性强的洗脱剂对极性弱的试样宜采用极性弱的洗脱剂

三、尺寸排阻色谱法（SEC)

尺寸排阻色谱法（凝胶色谱法）：用于较大分子的分离，基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离。（一）、分离原理具有一定孔穴，体积大的分子不能渗入孔穴，先淋洗出；中等体积的分子部分渗透；小分子完全渗入，最后洗出色谱柱（二）、固定相1、软性凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶2、半刚性凝胶：高交联度的聚苯乙烯3、刚性凝胶：多孔硅胶、多孔玻璃（三）、流动相

所选用的流动相必须能溶解样品，并与凝胶本身非常相似以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。(常用:四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺、水）四、分离类型的选择（一）、根据相对分子质量选择相对分子质量低的样品——挥发性好，适合用GC相对分子质量200-2000——标准液相色谱类型（液—固液—液、离子交换色谱）相对分子质量>2000——尺寸排阻色谱（二）、根据溶解度选择

样品可溶于水并属于能离