claudin-1表达与胶质瘤侵袭分级和预后的关系

claudin-1表达与胶质瘤侵袭分级和预后的关系

橡胶瘤是最常见的脑肿瘤。其死亡率高和预后差的原因主要与胶质瘤的分化程度、侵袭生长、细胞增殖和血管生成密切相关。肿瘤的组织学分级是重要的预后参数,其中与肿瘤细胞的极性变化密切相关,而控制肿瘤细胞极性的最重要分子成分是细胞的紧密连接。紧密连接由整合素蛋白组成,例如occludin、claudin家族以及连接相关蛋白如ZO-1。目前已知Claudin家族有24个成员,以组织特异性的模式表达。Claudin通过两个细胞外的环相互连接。近来有关Claudin基因在不同肿瘤中的表达的研究逐渐增多,但其确切的表达模式尚不知道,仅仅在少量的肿瘤上对有限的Claudin基因进行研究,有关Claudin在胶质瘤进展中的作用目前未见文献报道。本文应用免疫组化方法研究Claudin-1在胶质瘤中的表达及其与Ki-67、微血管密度的关系,探讨Claudin-1的表达在胶质瘤发生发展的意义。1材料和方法1.1质瘤两组年龄的性别分布取自福建医科大学附属第一医院病理科2002年1月～2006年12月手术切除胶质瘤存档蜡块50例,其中男26例,女24例,年龄15～70岁。所有标本均经常规4%中性甲醛固定,HE染色,按照WHO肿瘤分类(2000年)神经系统肿瘤病理学与遗传学分册标准进行胶质瘤的分级,其中≤Ⅱ级的胶质瘤17例,Ⅲ～Ⅳ级33例。1.2单克隆抗体检测兔抗人Claudin-1多克隆抗体,购自美国ZYMED公司,鼠抗人Ki-67单克隆抗体(克隆号MIB-1)和CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)购自美国NeoMarkers公司,EnVision二步法非生物素免疫组化试剂盒购自美国DAKO公司。所有操作严格按照说明进行。用已知乳腺癌Claudin-1阳性切片为阳性对照,PBS代替一抗为阴性对照。1.3细胞内表达分析选择具有非肿瘤区、肿瘤与非肿瘤移行区(交界区)和肿瘤区的切片进行研究分析。Claudin-1阳性染色者在细胞膜和/或浆有棕黄色颗粒沉着。根据肿瘤细胞膜和/或浆的染色程度以及染色细胞百分率进行分析评分:基本不着色者为0分;着色淡者为1分;着色适中者为2分;着色深者为3分。着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;≥51%为3分。将每张切片相同区域的肿瘤细胞着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘,为每个区域肿瘤细胞染色的最后得分。得0～1分为阴性(-);得2～3分为弱阳性(+);得4～6分为中等阳性(++);6分以上为强阳性(+++)。1.4微血管密度检测CD34阳性染色定位于血管内皮细胞,呈棕黄色颗粒沉着,脑组织内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表一条单独得微血管。在10×物镜下分别在不同的分区挑选微血管分布最高的区域,然后在40×物镜下(0.196mm2/每视野)计数5个视野中被CD34染成棕黄色的血管数目,取其平均值作为微血管密度。分辩不清或染色模糊的细胞不计入。1.5ki-67原子能育种抗剂的评价标准阳性染色者为细胞核呈现深棕色颗粒沉着。分别在不同区域计数1000个肿瘤细胞中Ki-67阳性标记细胞数即为不同区域的标记指数。1.6统计处理统计分析采用SPSS12.0软件进行。计数资料采用χ2检验,计量资料组间比较采用t检验。2结果2.1cladin-1对胶原瘤的检查Claudin-1表达与胶质瘤患者的年龄、性别、肿瘤发生部位其差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。2.2不同级别胶质瘤claudin-1表达情况在非肿瘤区,高、低级别的胶质瘤其Claudin-1的表达(图1a,图2a)未见明显差别;在胶质瘤交界区(侵袭前沿),高级别胶质瘤Claudin-1表达率(图2b)明显高于低级别的胶质瘤(图1b)(P<0.05);而在肿瘤区,低级别胶质瘤Claudin-1的表达率(图1c)明显高于高级别的胶质瘤(图2c)(P<0.05)(表1)。2.3胶质瘤ki-双n-9ki-双1除非肿瘤区外,高级别胶质瘤Ki-67标记指数明显高于低级别胶质瘤(P<0.05)。对于低级别胶质瘤来说,虽然肿瘤区的Ki-67标记指数高于非肿瘤区,但无统计学差异;而对于高级别的胶质瘤,肿瘤区的Ki-67标记指数明显高于交界区和非肿瘤区,交界区也高于非肿瘤区(P<0.05)(表2)。2.4双侧菌株7的表达低级别胶质瘤不同分区中Claudin-1的表达与Ki-67的表达未见明显关系;高级别的胶质瘤,除非肿瘤区外,高表达Claudin-1的胶质瘤其Ki-67的标记指数明显高于低表达Claudin-1者(P<0.05)(表1)。2.5低级别胶质瘤中,各组织的mvd的比较在肿瘤区高级别的胶质瘤的MVD高于低级别胶质瘤的MVD,而在非肿瘤区和交界区无明显差异(P>0.05)。在低级别胶质瘤中,肿瘤区的MVD高于非肿瘤区和交界区的MVD,非肿瘤区和交界区间MVD未见明显差异(P>0.05);而在高级别胶质瘤中,肿瘤区MVD高于非肿瘤区和交界区MVD,交界区MVD高于非肿瘤区(P<0.05)(表2)。2.6结果表达数及>级胶质瘤中ki-双不论在肿瘤区、交界区还是非肿瘤区,Claudin-1的表达与MVD未见明显相关性(P>0.05)(表1)。△表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤肿瘤区Claudin-1表达率与<Ⅱ级胶质瘤比较,P<0.05#表示Ⅲ～Ⅳ级胶质Ki-67标记指数与<Ⅱ级胶质瘤比较,P<0.05□表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤肿瘤区和交界区Claudin-1高低表达组Ki-67标记指数间的比较,P<0.05☆表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤交界区和肿瘤区MVD水平与<Ⅱ级胶质瘤比较,P<0.05△表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤交界区与非肿瘤区Ki-67标记指数比较,P<0.05#表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤肿瘤区与非肿瘤区Ki-67标记指数比较,P<0.05□表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤肿瘤区与交界区Ki-67标记指数比较,P<0.05☆表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤肿瘤区MVD水平与<Ⅱ级胶质瘤比较,P<0.05○表示胶质瘤交界区与非肿瘤区MVD水平比较,P<0.05

表示胶质瘤交界区与肿瘤区MVD水平比较,P<0.05◎表示Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤交界区与非肿瘤区MVD水平比较,P<0.053claudin-1与肿瘤的关系Claudin属于一类跨膜紧密连接蛋白,目前已发现有24个家族成员,分子量在～17-27kDa之间,其主要作用是确定通过细胞间分子的大小,第一个Claudin基因(CLDN1)是在筛查与整合素紧密连接蛋白,occludin相互作用的鼠类蛋白时鉴定的,与occludin、连接粘附分子1(JAM1)等其他整合素膜蛋白一起形成特异性的膜功能,包括维持细胞的极性和细胞间屏障功能。紧密连接蛋白表达的降低常导致肿瘤细胞极性消失及细胞间紧密连接功能失常。另外紧密连接蛋白还参与细胞增殖,分化的调节。Claudin蛋白主要位于细胞膜和/或细胞浆,目前的研究结果不一致,一些研究发现Claudin蛋白表达下调或不表达,另一些研究发现表达上调。作者通过观察肿瘤的侵袭情况,镜下将胶质瘤分为非肿瘤性区、肿瘤与非肿瘤交界区和肿瘤区,通过比较不同区域中Claudin-1的表达来探讨与肿瘤生物学行为间的相关性。结果显示Claudin-1的表达与患者年龄、性别和发生部位无关,而与肿瘤的侵袭、组织学分级以及肿瘤的增生密切相关。Sheehan等发现前列腺癌中Claudin-1表达降低与肿瘤的分级呈负相关,分级越高Claudin-1表达越低,多因素分析提示Claudin-1表达降低是前列腺癌独立的预后参数。Higashi等也发现Claudin-1表达的丢失与肝细胞癌的组织学分级、静脉内癌栓形成明显相关,低分化和门静脉癌栓形成的肝细胞癌Claudin-1表达丢失,提示Claudin-1表达下调可作为肝癌患者预后差的标志。目前仅见Claudin-1在胶质母细胞瘤血管内皮细胞中表达的研究。本文也有相似的结果,研究发现Claudin-1的表达与胶质瘤的侵袭、分级和瘤细胞的增殖明显相关,高级别的胶质瘤Claudin-1表达降低,即丢失率增加。同时首次发现一个有趣的Claudin-1表达相反的现象,即Claudin-1的表达模式在肿瘤交界区与在肿瘤区明显不同,在胶质瘤交界区高级别的胶质瘤其Claudin-1表达率明显高于低级别的胶质瘤(P<0.05),而在肿瘤区高级别的胶质瘤其Claudin-1表达率明显低于低级别的胶质瘤(P<0.05)。这种表达模式相反的现象尚难以解释,提示在胶质瘤进展的不同阶段Claudin-1可能发挥不同作用,待深入研究。研究发现Ki-67标记指数与胶质瘤的组织学分级和预后密切相关,Ki-67标记指数越高的胶质瘤患者其生存时间和复发时间越短本研究也发现高级别的胶质瘤Ki-67标记指数明显高于低级别的胶质瘤;同时高级别胶质瘤的肿瘤区Ki-67标记指数明显高于交界区和非肿瘤区,交界区也高于非肿瘤区。Halasz等在肝母细胞瘤中发现Claudin-1的表达与肿瘤细胞的增殖活性负相关,提示侵袭强、高增殖活性的胚胎表型与Claudin-1表达降低/丢失有关。本文研究结果与之相反,显示高级别的胶质瘤Claudin-1的表达与Ki-67的标记指数呈正相关性,即Claudin