双乙酰在啤酒酿造中的应用

双乙酰在啤酒酿造中的应用

啤酒成熟的一个重要方面是啤酒的成熟。将双盏灯的含量降至最低是啤酒成熟的主要目的，也是成熟时间限制因素。双乙酰赋予啤酒特殊风味,但当其含量超过阈值(0.15mg/L)时,就会影响啤酒的风味和质量,带来不愉快的馊饭味。鉴于双乙酰含量对于啤酒的风味有着重要的影响,国际上已把此项作为检验啤酒质量的一个重要指标。我国在七十年代引入此理论,把它列入啤酒标准中,GB4927-91中规定优质啤酒双乙酰含量必须≤0.13mg/L。但是由于生产中的一些偶然原因或技术问题(如麦汁质量差,辅料添加太多,酵母种类、添加量以及酵母质量的影响,卫生条件差,发酵条件等)影响双乙酰的形成和转化,使成品啤酒中双乙酰的含量过高或者罐装后容易回升。寻找各种方法解决这个问题关系到啤酒风味稳定性和质量,并且通过快速降低双乙酰的含量来促进啤酒的成熟可以缩短发酵周期,从而提高设备的利用率及降低生产成本。本文主要介绍一下国内外解决双乙酰问题的几种方法和酶法处理的研究进展。对啤酒成熟过程中用到的主要酶制剂一α-乙酰乳酸脱羧酶的作用机理及研究进展情况作具体介绍。1双乙醇1.1-乙酰乳酸法啤酒酿造中的双乙酰来源很复杂,主要是由α-乙酰乳酸非酶自然氧化形成。α-乙酰乳酸非酶氧化的速度远低于酶促还原的速度,所以双乙酰形成、转化的限速反应历程为非酶氧化历程。双乙酰的转化机制如图1所示。α-乙酰乳酸是由酵母合成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸时的中间产物,α-乙酰乳酸可通过酵母细胞壁和细胞膜溢出,然后经过非常缓慢的过程转化为双乙酰。双乙酰重新被酵母吸收,在还原酶的作用下转化为乙偶姻,乙偶姻再进一步转化为2,3—丁二醇。若α-乙酰乳酸不能在发酵前期迅速氧化分解,在发酵后期乃至贮酒期由于发酵液中氧化-还原电位下降,α-乙酰乳酸氧化更困难,它就不能彻底转化为双乙酰而残留于啤酒中。在罐装后,由于瓶中存在空气和溶解氧,α-乙酰乳酸会继续氧化分解成双乙酰。此时已不存在还原酶,导致成品啤酒中双乙酰的回升,影响啤酒的质量和口味。1.2啤酒酿造过程中双乙酰的制备1.2.1影响双乙酰形成和转化的因素:1、酵母品种;2、后发酵温度太低,引起酵母沉积;3、缬氨酸抑制乙酰乳酸生成,应该保证麦汁中一定的氨基氮含量;4、发酵温度越高、酸度越低,则双乙酰转化速度越快;5、酿造用水的残余碱度;6、麦汁中的锌含量;7、边加麦汁边加酵母,使充分混合;8、麦汁中充分的溶解氧,但除此之外发酵过程应避免接触空气。氧气是酵母繁殖必需,但是过多会增加双乙酰量。1.2.2除去双乙酰的方法根据啤酒酿造工艺中双乙酰形成和转化的限制性因素,可以针对性地采取一些方法。目前国内外除去双乙酰采用的方法很多,一种主要的酶学方法是利用α-乙酰乳酸脱羧酶的活性。可以在酿造中直接添加α-乙酰乳酸脱羧酶,或者通过基因重组,使啤酒酵母获得α-乙酰乳酸脱羧酶基因从而产生α-乙酰乳酸脱羧酶,亦可利用固定化酵母或固定化α-乙酰乳酸脱羧酶处理啤酒中双乙酰。2-乙酰乳酸法α-乙酰乳酸脱羧酶是20世纪90年代初期应用于啤酒生产的一项新技术,它能将啤酒生产过程中双乙酰的前体物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻,从而快速降低啤酒中双乙酰的含量。2.1生化途径中-乙酰乳酸的降解主发酵时若麦芽汁中没有足够的游离缬氨酸,酵母将启动自身的缬氨酸合成机制。在缬氨酸合成的生化途径中(如图1所示),α-乙酰乳酸除了可以经过非酶氧化途径缓慢合成双乙酰外,也可以在α-乙酰乳酸脱羧酶的作用下快速直接生成乙偶姻。所以它能快速消除发酵液中的α-乙酰乳酸,使其不能转化为双乙酰。从而大大地减少由α-乙酰乳酸生成双乙酰的数量,缩短双乙酰的还原时间。2.2能力q/bioc006-2001外观为淡褐或深棕色的水溶液,无沉淀,略有微生物培养基香味,无杂质。主要技术性能指标根据Q/BIOC006-1997为:活力(U/mL)≥2000;总活菌计数/g<3000;铅≤1mg/kg;砷≤1mg/kg;汞<10mg/kg;pH值5.5～7.0;大肠菌群≤30个/100g;致病菌不得检出。2.3脱羧酶系统集成酶α-乙酰乳酸脱羧酶应用于啤酒成熟有广阔的前景。但是酵母本身不存在α-乙酰乳酸脱羧酶活性。从八十年代开始,国外就α-乙酰乳酸脱羧酶做了很多工作。1982年Godtfredsen等从产气肠道杆菌1033(Enterobacteraerogenes1033)中提纯α-乙酰乳酸脱羧酶,首次利用这种酶在10℃,24h内完成α-乙酰乳酸氧化脱羧直接转化为乙偶姻。他们从广泛应用于食品工业酶制剂生产的地衣芽孢杆菌中提纯出酶活为800U/mg的乙酰乳酸脱羧酶,达到工业化应用水平。并且未发现添加酶对酵母的发酵速率和活力有任何不良影响。丹麦Novo公司采用枯草杆菌生产乙酰乳酸脱羧酶作为商品销售。目前普遍认为在很多细菌尤其是杆菌中存在α-乙酰乳酸脱羧酶活性,可以从中选育出α-乙酰乳酸脱羧酶活性较高的菌株。但未在真菌、海藻和原生动物等真核生物中发现该酶活性。八十年代末期已经有人从事细菌ALDC基因在酵母中的克隆和表达的研究。如Sone等在1988年和1989年克隆了产气肠杆菌IFO13534菌株的ALDC基因,并分别在大肠杆菌和啤酒酵母中表达。目前国外啤酒生产技术已经成熟,对α-乙酰乳酸脱羧酶的研究更加注重微生物工程、酶工程、基因工程以及基础理论的研究。我国从事α-乙酰乳酸脱羧酶的理论和应用研究是在九十年代以后,总体来说和国外相比存在很大的差距,在上述方面的研究还不成熟。不过目前α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒中的应用已经被很多厂家接受。下面分别介绍一下近几年国内外α-乙酰乳酸脱羧酶研究方面的有关情况。国外这方面研究的比较多,而且开始研究也比较早,在上面已经作了简要的介绍。下面举例说明一下国内的进展。自2000年以来,黄建新、郑华军等人从不同的地衣芽孢杆菌中筛选得到ALDC酶活较高的菌株,并对它们的理化性质进行分析。黄建新等筛选得到一株初产ALDC较高的地衣芽孢杆菌H6(BacilluslicheniformisH6)。郑华军等对地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)AS10106的ALDC分离、纯化得到电泳纯,比活提高了53.5倍,能明显降低双乙酰的形成。该酶单亚基分子量为32Kda,等电点为4.5,最适反应温度为40℃,最适pH为6.0,对热(40℃以上)敏感,在pH5.0～6.5之间稳定。酶活不需要金属阳离子,Cu2+、Co2+强烈抑制酶的活性。周文斌等对地衣芽孢杆菌BL—4菌株诱变得到高产菌株,酶活比出发菌株高1.22倍。该菌株最佳发酵产酶条件和郑华军等的研究结果有相似之处,最佳反应温度较低,只要30℃。何秀萍等对16个菌种的ALDC进行测定,结果表明不同来源的ALDC的反应速度曲线、生理生化特性有一定的差异。支链氨基酸对ALDC活力有明显的影响。酶反应体系的pH对酶活力有显著影响,如乳酸乳球菌最适6.6,产气气杆菌5.8。不同浓度的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸对酶活有显著影响。2.3.1.发酵剂和清酒以及在麦汁中的使用根据具体情况,ALDC的添加有几种情况。在冷却麦汁中和酵母一起加入发酵罐、在发酵过程中添加或者在清酒中使用。该酶添加到冷却后的充氧麦汁中,在不改变工艺参数的条件下大大降低发酵周期。在麦汁中添加可以减少双乙酰的还原时间,缩短发酵周期2～3d,并且可以降低双乙酰的峰值,减少啤酒装瓶后的回升。如果只是偶然出现双乙酰峰值高的现象可在发酵液中或者清酒中添加ALDC来补救。2.3.1.固定化alcd的工艺固定化ALDC有很多优点,如:(1)可把固定化ALDC从啤酒发酵液中分离;(2)大大提高ALDC的稳定性;(3)可在较长时间内反复使用;(4)啤酒发酵液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;(5)酶的使用效率提高,啤酒成本降低。我国钱斯日古楞等用磁性淀粉微球作为载体,采用溴化氰活化法、戊二醛交联法及物理吸附法固定化ALDC,并对它的理化性质进行了对比。发现ALDC被固定后的热稳定性、储存稳定性均比自由酶好,并具有很强的操作稳定性。国外研究亦表明固定化酶与游离酶相比具有节约成本的优势。世界酿造大会2004年度报告中指出,利用IMMOPORE载体固定ALDC,实现啤酒的连续化成熟。基本技术流程为:主发酵后的发酵液→离心分离除去酵母→得到的生啤酒巴氏杀菌30S→IMMOPORE载体固定化ALDC反应器→储酒罐后熟用这个方法处理的好处是巴氏杀菌的时间非常短(只要30s),处理以后几乎不改变啤酒的口感,而长时间热处理会使啤酒的口感发生显著的变化。IMMOPORE载体固定化ALDC处理10min后,生啤酒打到用IMMOPORE载体固定酵母的储酒罐中后熟,这个过程一般需要2～3h。经过中试得到的啤酒质量非常好。采用此固定化方法可以实现啤酒的低温发酵,还可以降低生产成本,提高收益。2.3.2基于alcd基因的啤酒酵母发酵采用基因手段构建双乙酰较低的啤酒酵母可以通过增强α-乙酰乳酸脱羧酶活性来实现。通过基因重组技术,使啤酒酵母获得α-乙酰乳酸脱羧酶基因,从而产生α-乙酰乳酸脱羧酶,催化细胞内α-乙酰乳酸进行氧化脱羧转化为乙偶姻,降低双乙酰的含量。Sone等克隆了产气肠杆菌IFO13534菌株的ALDC基因并分别在大肠杆菌和啤酒酵母中表达,之后有一些人分别把产气肠杆菌、土生克雷伯氏菌等的ALDC基因克隆到啤酒酵母中表达。芬兰VTT生物技术研究室和日本麒麟啤酒公司关键技术中心研究室合作从产气肠杆菌VTT-E37292菌株将编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因分离出整合到啤酒酵母形成基因重组菌。在50L的发酵扩大试验中,发酵时间约缩短1/2,风味物质及泡沫均无影响,经过连续5代使用,发酵性能稳定。近年来我国科学工作者也进行了ALDC基因在啤酒酵母中表达的研究。基因重组菌的生长和发酵性能均与亲株相同,并未受到影响。只不过基因重组菌积累的α-乙酰乳酸减少了。郭文洁、何秀萍等将枯草芽孢杆菌ALDC基因通过整合型载体引入到工业用啤酒酵母中。通过比较不同时间原始菌株PJ3-5及YT35ALDC酶活性较高的转化YT35发酵液中双乙酰含量(图2),可以看出转化YT35发酵液在整个发酵过程中双乙酰含量都比较低,发酵6～7d后双乙酰含量降低到味阀值以下。而原始菌株产生的双乙酰量高并且需要12d才将双乙酰降到阀值以下。可见通过基因重组技术构建的啤酒酵母工程菌使啤酒熟化时间缩短近一半。张沛、张博润等通过研究表明,图2的试验结果具有高度的重现性,并进一步发现ALDC基因的引入没有影响酵母的生理生化性状,啤酒酵母的发酵性状,包括发酵度、糖代谢、氨基酸代谢、风味物质等均没有显著的差异。啤酒酵母工程菌经过连续传代实验,其双乙酰代谢(包括α-乙酰乳酸脱羧酶活性、工程菌的抗铜性)、生理生化性状、发酵性状等随着工程菌传代次数的增加有变化,但都基本保持稳定。应该说ALDC基因在酵母染色体上是能够稳定遗传的,不随着使用代数的增加而发生明显的丢失。2.4-乙酰乳酸脱羧酶的加工直接添加酶制剂时,应该注意:1、应该明确ALDC不宜作为日常使用的添加剂,但可在发酵异常进行补救时采用。长期使用会造成酵母还原双乙酰的能力退化,并且啤酒的成熟度不仅仅取决于双乙酰含量的高低,其他风味物质也影响着啤酒的口感。生产厂家不能单纯依靠添加α-乙酰乳酸脱羧酶来啤酒催熟,还要注意提高原料及啤酒酵母的质量、改善生产条件以及采用先进的生产工艺等;2、要选择好添加时机,添加量要根据实际情况及需要确定,一般在发酵液中加量为10g/t,在清酒中的加量可以根据的α-乙酰乳酸残留量的多少来添加,一般加