虎耳草乙醇提取物抑菌活性的研究

虎耳草乙醇提取物抑菌活性的研究

虎耳草是虎耳草科的一种多年生多年生草本植物。它是一种天然的野生虎耳草，通常生长在潮湿的山坡上，在黄黄大地区。其主要成分有岩白菜素(bergenin)、槲皮素-3-鼠李糖苷(ouarcitrin)、槲皮素、原儿茶酸、没食子酸、琥珀酸、反甲基丁烯二酸等。虎耳草药用可治急性中耳炎、风热咳嗽等,农业上有用于抑制葡萄霜霉病菌的报道。但目前有关虎耳草药理方面的研究还很少。本文开展了虎耳草抑制细菌、酵母和霉菌生长的实验研究,对进一步了解虎耳草的抑菌机理和综合开发利用该植物具有重要理论和实践意义。1菌种和培养基主要仪器和设备:恒温培养箱、电子天平、循环水真空泵、旋转蒸发仪、电热高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电热干燥箱等。主要药品:95%乙醇、琼脂、氯仿、蔗糖、KCl、K2HPO4、FeSO4、MgSO4·H2O、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨等。武汉大学生命科学院提供的菌种为:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。细菌培养基(1000ml):牛肉膏3g、蛋白胨5g、琼脂15—20g,加水至1000ml,调pH为7.2—7.4。酵母及霉菌培养基(1000ml):蔗糖30g、琼脂15—20g、KCl0.5g、K2HPO41g、FeSO40.01g、NaNO33g,加水至1000ml,调pH为6.7。2实验方法2.1虎耳草醇提物的制备虎耳草由作者采自湖北省黄冈师范学院生命科学与工程学院的植物园。我们将鲜采的植物全株洗净、晾干、剪碎,先称取20.00g,置于75℃恒温烘箱中烘11h左右,使其达到恒重,再次称重得6.67g。由此可知,实验所用的虎耳草材料的含水量为66.65%。另取5kg虎耳草(折算后的干重为1667.5g)置入95%酒精中浸泡30d,期间经常搅拌;然后用棉花阻隔过滤,用旋转蒸发仪蒸发浓缩,得膏状物2312g。通过烘干和称重得知被乙醇浸泡提取后的虎耳草残渣干重为1371g,可见虎耳草原材料中有296.5g成分被提取进入膏状物中,膏状物的含水量约为87.2%(1g膏状物相当于0.72g干燥虎耳草),膏状提取物冷藏备用。2.2不同浓度的培养基平板时培养的微生物称取膏状提取物后用适量无菌水溶解,再用移液管定量吸取溶解液并转移至培养皿中。根据每培养皿中膏状物含量的多少分别设置7个浓度梯度,即每皿分别为0.1g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g和空白组。接着将已加热熔化的培养基按每皿12ml分别添加到培养皿中并与膏状物均匀混合,然后放在高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭菌15min,最后制成含一定浓度提取物的培养基平板,每一浓度的培养基平板重复3皿冷藏备用;将已活化的细菌种液、酵母菌种液和霉菌种液先用无菌水作适当稀释,接种到上述各培养皿中,用涂布耙将菌液涂布均匀,然后放到培养箱(细菌37℃、酵母和霉菌28℃)中培养。由于细菌生长较快,所以必须每天定时观察。由于青霉和酵母生长较慢,所以可在培养3d之后再开始每天定时观察。每次观察时都要用测微尺测量菌落直径大小,并用计数器记录视野内的菌落数目。实验过程中,如果发现所培养的微生物除空白组能生长外,其它浓度组都不能生长,说明微生物生长已被完全抑制,这时必须降低提取物浓度,然后重复实验过程。如果发现所有浓度组中的微生物都能生长,且菌落大小、数目等都相近或相似,说明微生物生长未受影响,这时则应提高提取物浓度,重复实验操作过程,继续观察抑制作用是否发生。如此反复几轮,最终就可找到能够抑制微生物生长的最小浓度(MIC)。3结果与讨论3.1不同浓度的膏状乙醇提取物对枯草芽孢杆菌生长的抑制作用我们利用膏状提取物每皿含量分别为0.1g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g和空白对照培养基培养6种待试微生物,细菌培养4d、产黄青霉和啤酒酵母培养6d后的观测结果统计见表1。表1说明,当每一培养皿(含12ml培养基)中膏状乙醇提取物的含量提高到1.0g时,金黄色葡萄球菌的生长就会受到完全抑制;当每一培养皿中膏状乙醇提取物的含量提高到1.5g时,苏云金芽孢杆菌的生长就会受到完全抑制;当每一培养皿中膏状乙醇提取物的含量提高到2.5g时,大肠杆菌的生长会受到完全抑制;当每一培养皿中膏状乙醇提取物的含量提高到2.0g时,枯草芽孢杆菌的生长会受到完全抑制。可见,虎耳草乙醇提取物对4种细菌的生长都有明显的抑制作用。此外,当培养皿中膏状乙醇提取物的含量逐渐增加时,每一培养皿中菌落个数一般都会减少,但菌落直径则不然,其中金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌落直径有逐步变大的趋势,而大肠杆菌的菌落直径则有逐步变小的趋势,这一现象是否说明虎耳草的这种抑菌作用既可完全抑制又可部分抑制?针对这一问题,我们利用液体培养测定细菌生长曲线的方法进一步研究了提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用情况。初步研究结果表明:虎耳草乙醇提取物中天然成分复杂,生物活性千差万别,有些成分能抑制细菌生长,另一些成分似乎还可以促进其生长;在提取物取活性成分的综合作用下,细菌生长曲线的对数生长期都有所提前;比较生长曲线稳定期细菌生物量的变化后发现,提取物的抑菌作用往往只在某一浓度时最强,高于或低于这一浓度时变弱,有时甚至表现为促进作用。如用含膏状提取物0.01g·ml-1、0.05g·ml-1和0.10g·ml-1的液体培养基培养葡萄球菌时,抑制作用会随提取物浓度增加而增强,当提取物浓度高于0.10g·ml-1且分别等于0.15g·ml-1、0.20g·ml-1和0.25g·ml-1时,原来的抑制作用变成了促进作用,因为在这3种提取物浓度下,细菌生物量都高于对照组。表1还表明,当每一培养皿中膏状乙醇提取物的含量由0.1g增至2.5g时,产黄青霉除在菌落大小方面有些变化外,在菌落个数上未见明显的变化趋势;与此同时,啤酒酵母的生长也未见抑制作用发生。3.2培养基的制备在上述实验的基础上,我们进一步精确配制每皿(12ml培养基)含膏状提取物0.6g、0.7g、0.8g、0.9g的平板培养基并用以培养金黄色葡萄球菌;精确配制每皿含膏状提取物1.1g、1.2g、1.3g、1.4g的平板培养基并用以培养苏云金芽孢杆菌;精确配制每皿含膏状提取物2.1g、2.2g、2.3g、2.4g的平板培养基并用以培养大肠杆菌;精确配制每皿含膏状提取物2.6g、2.7g、2.8g、2.9g的平板培养基并用以培养枯草芽孢杆菌。培养实验结果表明:金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等4种细菌分别在每皿0.9g、1.1g、2.3g、1.7g等浓度的培养基上不能生长,而在对应的较低浓度的培养基上可以生长。由此判定,虎耳草乙醇提取物(膏状物)对这4种细菌的最小抑菌每皿浓度分别为0.9g、1.1g、2.3g和1.7g。我们对产黄青霉和啤酒酵母还使用每皿3.0g、4.0g、5.0g等含较高浓度膏状提取物的培养基作抑菌实验,实验结果显示,产黄青霉和啤酒酵母在所有浓度的膏状提取物培养基上都能生长,即高浓度的虎耳草乙醇提取物对产黄青霉和啤酒酵母生长均无抑制作用。3.3虎耳草乙醇提取物对酵母生长无抑制作用的实验结果主虎耳草分布广泛、生长迅速、生命力强,在大别山地区野生资源非常丰富。虎耳草乙醇提取物对