弓形虫环介导等温扩增反应体系的建立及应用

弓形虫环介导等温扩增反应体系的建立及应用

这是一种特殊的细胞寄生虫（1908），发现了在牙齿和动物帮俞（1908）级织尿组织中发现的独特细胞寄生虫。它显示了一种缺乏营养的状态。换句话说，只能将牛仔布转换成鸟类饲料，但不能反向转化。因此,宿主细胞的腺苷成为弓形虫合成嘌呤最有效的补救来源,而三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase,NTPase)在此过程中起关键作用。它可以利用宿主来源的ATP,将其分解成AMP后,被速殖子膜上的5′-核苷酸酶水解生成腺苷,以合成自身所必需的嘌呤核苷酸。编码该酶的基因具有高度保守性,且其碱基序列在强弱虫株中略有不同,但目前尚未见将该基因用于诊断的研究报道。弓形虫因能引起对人类健康和畜牧业发展具有严重危害的人兽共患弓形虫病而备受人们的关注,其诊断方法也在不断发展,主要包括病原学、免疫学和分子生物学检查等。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术自Notomi等于2000年报道以来,以其特异性高、敏感性强、操作简便、快速等优点得到人们普遍应用。本研究选取弓形虫NTPase基因的保守序列为靶基因,建立LAMP诊断方法,以期为后期快速检测田间样品奠定基础。1材料和方法1.1基因组dna和血液原虫病弓形虫GJS株由中国农业科学院兰州兽医研究所人兽共患原虫病课题组分离、保存,犬新孢子虫基因组DNA由中国农业大学刘群教授惠赠,鹦鹉热衣原体基因组DNA由中国农业科学院兰州兽医研究所人兽共患细菌病课题组提供,柔嫩艾美耳球虫基因组DNA由中国农业科学院兰州兽医研究所人兽共患绦虫病课题组提供,羊巴贝斯虫未定种、牛巴贝斯虫、吕氏泰勒虫基因组DNA由中国农业科学院兰州兽医研究所血液原虫病课题组提供。大肠杆菌JM109、载体pMD19-T均为大连宝生物工程有限公司产品。1.2实验动物2月龄长白猪(弓形虫IHA抗体效价≤1∶4),体重(15±2)kg,由甘肃省兰州市榆中县某猪场提供。1.3基因组织、活性成分、kpn、dntps和氨基酸提取试剂盒BstDNA聚合酶为NEB公司产品;PremixTaq酶、限制性内切酶KpnⅠ、dNTPs、基因组提取试剂盒、DL1000DNAMarker均为大连宝生物工程有限公司产品;甜菜碱为Sigma公司产品;其他试剂均为国产分析纯。1.4ssr引物的设计根据NCBI中的序列(登录号为L39079),设计NTPase基因PCR引物,引物由大连宝生物工程有限公司合成(见表1)。构建重组阳性质粒pMD19-T-NTPase。1.5引物的设计与合成对弓形虫NTPase基因用PrimerExplorerV4在线软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物,引物由大连宝生物工程有限公司合成(见表2)。1.6ntpase-pcr反应体系的构建以本试验中LAMP的端引物F3和B3为PCR引物,以构建的阳性重组质粒为模板,建立NTPase-PCR反应体系,总体系为25μL。1.7反应系统的lampLAMP反应体系按杨吉飞等的优化条件操作。1.8酶切鉴定及鉴定将扩增的目的片段使用软件PrimerPremier5.0进行酶切位点分析,用限制性内切酶KpnⅠ对LAMP产物进行酶切鉴定,37℃作用4h。反应后用10g/L的琼脂糖进行电泳。1.9lamp特异性试验利用建立的LAMP方法,对犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种、牛巴贝斯虫和弓形虫基因组DNA进行LAMP特异性试验。反应后用10g/L的琼脂糖进行电泳。1.10抗lamp敏感性测试1.10.lamp反应的敏感性检测将已知浓度的弓形虫阳性质粒模板定量到100ng/μL(即拷贝数为1×108copies/μL),然后将其依次稀释为1×10-1～1×10-88个浓度后检测LAMP反应的敏感性。同时用相应浓度质粒DNA进行的NTPase-PCR反应做比较。反应后分别用10g/L的琼脂糖进行电泳。1.10.lamp和其他dna片段的检测用弓形虫GJS株强毒活虫腹腔接种试验猪3头,剂量为1×107/头。在攻虫前和攻虫后第2、3、4天于前腔静脉采血。以血液基因组为模板,分别进行LAMP检测和基于529bp重复DNA片段的PCR检测。PCR检测的引物和反应体系按Homan等的方法操作。2结果2.1反应条件确定通过优化LAMP的反应条件,确定本试验中最佳反应条件为65℃30min。将LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后,可见明显的瀑布状特异性条带,阴性对照不出现条带(见图1)。2.2lamp引物的反应性分析用限制性内切酶KpnⅠ对LAMP产物进行酶切鉴定,结果显示得到2个大小约为260bp和180bp的片段(见图2),表明设计的LAMP引物具有良好的反应性。2.3lamp反应对犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫进行LAMP反应。结果显示,上述DNA样品均没有扩增产物(见图3),表明该LAMP方法具有很高的特异性。2.4lamp和pcr方法检测质粒的灵敏度以不同浓度的阳性质粒pMD19-T-NTPase为模板进行LAMP和PCR反应。结果显示,LAMP方法可检测到20fg重组阳性质粒,即检测限为20copies,PCR方法可以检测到200fg重组阳性质粒,即检测限为200copies(见图4、5)。可见本试验建立的LAMP检测方法比PCR方法敏感性高10倍。对攻虫前和攻虫后第2、3、4天的3头试验猪采血提取血液基因组,分别用LAMP方法和PCR方法检测。结果显示,LAMP方法可以在攻虫后第2天看到清晰的瀑布状条带,而PCR方法在攻虫后第4天出现阳性条带(见图6)。3弓形虫基因检测LAMP方法是一种简便、快速的新式基因扩增方法,与PCR相比其最大的优势是反应所需的时间短。本研究中,LAMP反应在15min便可以检测到阳性重组质粒,而在反应进行到30min时,可检测到20copies重组NTPase基因,敏感性比普通PCR高10倍;而且LAMP方法不需要专门的反应仪器,只需恒温水浴锅就可以满足试验所需;此外,LAMP反应结果可以用浊度仪测其副产物——焦磷酸镁沉淀的浊度来观察。本试验中LAMP反应后沉淀的量很少,故采用琼脂糖凝胶电泳分析法进行观察。但是将该反应后产物离心,即可用肉眼观察到沉淀。NTPase约占弓形虫虫体总蛋白的2%～8%,在弓形虫生存和繁殖过程中起重要作用。且在原虫中只有犬新孢子虫存在该基因,而其他原虫如疟原虫、柔嫩艾美耳球虫等均无NTPase存在。因此,本研究选取弓形虫NTPase基因中216bp片段设计引物进行LAMP试验。结果显示,包括犬新孢子虫在内的其他虫株均为阴性,而弓形虫基因检测为阳性,说明本方法的特异性良好。本研究对早期感染弓形虫试验猪血液,用建立的LAMP方法和Homan等建立的PCR方法进行比较。虽然529bp重复DNA片段在弓形虫基因组DNA中有200～300个拷贝,而NTPase基因在弓形虫基因组DNA中是单拷贝基因,但LAMP方法可比PCR方法提前2d检测到血液样本中的弓形虫,且LAMP反应时间大大缩短。在全血中提取DNA时,可能会有一些遗留的PCR的抑制因子而影响PCR反应的特异性和敏感性,但这种抑制因子对LAMP反应无效。这不但进