基因工程制药-基因工程制药技术

基因工程制药技术（二）一、基因工程菌的培养过程1、摇瓶培养确定菌体生长基础条件，如温度、pH、培养基组成、表达产物合成对工程菌的影响等。2、发酵罐培养确定培养方案、培养参数。二、基因工程菌的培养方式1、分批培养2、补料分批培养3、连续培养4、透析培养指利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来接触其生产菌的不利影响。5、固定化培养固定化可以提高重组菌的稳定性，重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都有很大提高，许多宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。三、影响基因工程菌发酵生产的因素(一)、基因工程菌与传统微生物发酵工艺的差异传统微生物发酵主要收获的是初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。基因工程菌发酵是为了获得最大量的基因表达产物。培养基接种量培养条件（温度、pH、溶氧等）诱导时间（二）、影响重组菌发酵的因素1、培养基碳源、氮源、无机盐、微量元素等基因工程菌通常具有选择性标记基因，在培养基中应添加相应的成分。2、接种量接种量大小影响菌体生长繁殖速率3、培养温度（1）在复制水平上，温度可影响基因拷贝数量（2）在转录水平上，温度可影响RNA聚合酶的作用（3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质合成水平来影响基因表达（4）温度还影响蛋白质的活性和包涵体的形成例如，重组人生长激素工程菌，在30℃时的产物是可溶的，而在37℃所表达出的蛋白质则是不溶的4、溶解氧的影响外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的溶氧。通常采用改变转速的方法，改善氧的供给5、pH的影响影响细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达。不同诱导时机对重组苏氨酸脱水酶的影响6、诱导时机的影响案例1重组苏氨酸脱水酶的基因表达案例2L-天冬氨酸酶的表达诱导时机对L-天冬氨酸酶表达水平和活力的影响生物量（A600*10）酶活力酶表达水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达。诱导时机：各种酶的诱导剂或改变温度、pH等培养条件。诱导方式：7、诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间：又叫诱导时长，加入诱导剂后的培养时间。比酶活时间t不同诱导时长对重组苏氨酸脱水酶比酶活的影响随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。小结1、基因工程菌的培养过程和培养方式2、影响基因工程菌发酵生产的因素3、诱导时机和诱导时间对重组菌发酵生产的影响作业1、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？2、基因工程菌和传统微生物发酵的区别是什么？基因工程制药技术目的基因的分离重组DNA转入受体细胞外源基因在受体细胞中表达目的基因与载体的连接含重组体的受体细胞的筛选表达产物的分离纯化鉴定010305020406一、基因工程的基本操作过程质粒受体菌筛选转化重组质粒限制性酶切DNA连接酶目的基因含目的基因的外源DNA限制性酶切非转化菌转化菌上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成。基因工程药物生产的基本操作步骤下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。获得目的基因

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构建重组质粒

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组建基因工程细胞

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工程菌培养

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产物分离纯化将目的基因与载体连接后，转入受体细胞，即获得基因工程菌该过程也称为基因工程的上游技术（一）基因工程菌的构建与筛选特点：只能合成小于100个碱基的特定序列自动化程度高合成速度较快（1）化学合成法：将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。1、目的基因的制备即反转录法。利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称为cDNA文库。降解mRNA模板cDNA第二链的合成cDNA与载体连接总mRNA提取mRNA的分离纯化cDNA第一链的合成一般步骤（2）cDNA文库法根据生物体内DNA复制原理，在DNA聚合酶催化下，以来DNA模板特异性扩增DNA。特点：可在体外大量特异性扩增目的基因，实验室常用（3）PCR法PCR仪载体是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采用的DNA分子。包括质粒载体、病毒（包括噬菌体）等。2、载体具有有效运载能力载体自身能够独立复制，并能在宿主内进行自主性复制必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上必须带有标志基因，以便进行重组后的筛选基因工程载体必备条件载体应具有启动子载体应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可是宿主细胞免受这种影响应具有终止子，以便重点克隆外源基因区域，而不转录其他无关基因所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，以便转录之后能够顺利进行翻译。概念：指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。特征：具有遗传传递和遗传交换的能力进行独立复制，并随宿主细胞的分裂传递给后代可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响质粒载体（1）复制子又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素用于克隆表达的载体需要具有以下特征（2）多克隆位点指位于质粒中的一段序列，这段序列中含有多个限制性内切酶识别位点，且这些位点是单一酶切位点。抗生素抗性基因：氨苄青霉素，氯霉素，四环素、卡那霉素等。含有抗生素抗性基因质粒质粒的宿主细胞能在含抗生素的环境中生长。用于克隆表达的载体需要具有以下特征（3）选择性标记用于筛选转化有质粒的宿主细胞，是质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因。连接酶催化载体与目的基因DNA片段连接，形成重组子粘性末端的连接平头末端的连接3、目的基因与载体的连接常使用T4连接酶通常采用转化的方法。转化是指细胞在一定的生理状态时可以获取外源遗传物质，导致宿主细胞某些遗传性状发生改变。4、重组DNA转入宿主细胞抗药性基因的检测（最常见）基本原理抗药性筛选法可区分重组子与非重组子将外源DNA插入BamHⅠ位点：重组子呈现Apr、Tcs非重组子呈现

Apr、Tcr

5、重组子的筛选与鉴定

图2图1野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶分解X-gal成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，从而使整个菌落变成蓝色。蓝白斑筛选在插入外源基因后，突变型菌体的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β