DNA重组技术的基本步骤课件

1.2基因工程的基本操作程序DNA重组技术的基本步骤目的基因的检测与鉴定目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤DNA重组技术的基本步骤1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录DNA重组技术的基本步骤RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。DNA重组技术的基本步骤①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列.包括启动子和终止子DNA重组技术的基本步骤2.真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子

外显子

转录mRNA前体加工翻译肽链启动子终止子成熟mRNA能够编码蛋白质的序列。不能够编码蛋白质的序列。

外显子:

内含子:

DNA重组技术的基本步骤真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：包括非编码区和内含子DNA重组技术的基本步骤原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码DNA重组技术的基本步骤阅读与思考1、什么是目的基因？2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？请阅读P9第一和二两段DNA重组技术的基本步骤1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：Ⅰ、从基因文库中获取目的基因Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因Ⅲ、化学方法直接人工合成一、目的基因的获取DNA重组技术的基本步骤Ⅰ、从基因文库中获取目的基因基因文库

基因组文库部分基因文库DNA重组技术的基本步骤基因文库的构建过程限制酶拼接到载体上导入受体细胞扩增

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。基因组文库DNA重组技术的基本步骤cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)基因文库的构建过程DNA重组技术的基本步骤

真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思考？DNA重组技术的基本步骤基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较DNA重组技术的基本步骤怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?DNA重组技术的基本步骤如何从基因文库中找到所需要的基因？依据------目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性。DNA重组技术的基本步骤构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库ACDNA重组技术的基本步骤Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：

DNA复制

PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。选修3、P58DNA重组技术的基本步骤模板原料引物

酶控制温度利用PCR技术扩增目的基因——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸——耐热的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：DNA重组技术的基本步骤DNA重组技术的基本步骤过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一DNA重组技术的基本步骤加热至95摄氏度的目的是使DNA中的

断裂，这一过程在细胞内是通过

的作用来完成的。当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料是

，遵循的原则是

。Taq酶的特点是（）

A.耐强酸B.耐强碱

C.耐高温D.最适温度37摄氏度4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别

解旋酶C脱氧核苷酸碱基互补配对原则DNA重组技术的基本步骤DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等DNA重组技术的基本步骤用化学方法直接人工合成条件：基因较小，核苷酸序列已知。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测

化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？DNA重组技术的基本步骤反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推测推测单链DNA合成DNA重组技术的基本步骤2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥1．在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法

B、基因组文库法C、CDNA文库法

D、聚合酶链反应DNA重组技术的基本步骤3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个A.540B.8100C.17280D.7560DNA重组技术的基本步骤4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温A．①③④⑦⑧⑨B．①②④⑥⑦⑧C．①②⑤⑥⑦D．①③⑥⑦⑧D5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③DDNA重组技术的基本步骤（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用__________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:二、基因表达载体的构建—核心DNA重组技术的基本步骤质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种DNA重组技术的基本步骤2、基因表达载体的组成目的基因启动子:终止子:标记基因等一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。DNA重组技术的基本步骤启动子的作用：终止子作用：使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。

是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。DNA重组技术的基本步骤3、基因表达载体的构建目的：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因能够表达和发挥作用。思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？DNA重组技术的基本步骤不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。DNA重组技术的基本步骤①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意DNA重组技术的基本步骤

目的基因与运载体结合所需的条件有①同一种限制酶②具有抗性基因的质粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA连接酶⑥四种脱氧核苷酸⑦ATPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦C．①②③④⑤D．①②④⑤⑦（多选）一个基因表达载体的构建应包括

A．目的基因B．启动子

C．终止子D．标记基因ABCDDDNA重组技术的基本步骤下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别ADNA重组技术的基本步骤

1、什么是转化？

2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？

3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？

4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？三、目的基因导入受体细胞DNA重组技术的基本步骤转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。三、目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。DNA重组技术的基本步骤1.目的基因导入植物细胞常用的方法:农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌的特点:c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。b.具有趋化性。a.易感染双子叶植物和祼子植物。DNA重组技术的基本步骤（1）、农杆菌转化法DNA重组技术的基本步骤整合到染色体上转移至受体细胞DNA重组技术的基本步骤

根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？P15-2思考与探究因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌，

向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉管道法。DNA重组技术的基本步骤（2）基因枪法

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。1、常用于单子叶植物的转化方法2、特点：成本高DNA重组技术的基本步骤（3）花粉通道法

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得DNA重组技术的基本步骤２.目的基因导入动物细胞常用的方法:

显微注射技术操作程序：a.先提纯含目的基因的表达载体b.从雌性动物体内取出卵（受精卵）c.显微注射仪进行显微注射d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体DNA重组技术的基本步骤常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌3.目的基因导入微生物细胞原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。DNA重组技术的基本步骤大肠杆菌的转化过程:用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。增加细胞壁的透性，与细胞膜无关DNA重组技术的基本步骤

将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理DNA重组技术的基本步骤植物基因工程动物基因工程微生物基因工程常用方法受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法体细胞受精卵原核细胞DNA重组技术的基本步骤1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是A．结构简单、操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有①大肠杆菌②枯草杆菌③支原体④动植物细胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BDDNA重组技术的基本步骤1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？四、目的基因检测与鉴定DNA重组技术的基本步骤检测内容检测方法1.目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上2.目的基因是否转录出mRNA3.目的基因是否翻译出蛋白质4、个体生物学水平的鉴定分子杂交技术抗原—抗体杂交DNA分子杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA探针：用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。DNA重组技术的基本步骤（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交