纳他霉素与山梨酸复配对mrs培养基中真菌生长的影响

纳他霉素与山梨酸复配对mrs培养基中真菌生长的影响

蘑菇通常通过mrs培养基进行培养，但蘑菇、细菌和其他常见细菌很容易在培养培养基中生长。mrs培养基用于过滤和分离蘑菇，并计算蘑菇的计数是不理想的。因此，可以在mrs培养基中添加抑制细菌和其他常见细菌，但不影响蘑菇生长，从而优化mrs培养基。在MRS培养基中添加放线菌酮,对乳酸菌生长没有影响,但可抑制真菌,因其价格较昂贵而实际应用受到一定限制。本实验通过对添加不同浓度纳他霉素(Natamycin)与山梨酸(SorbicAcid)及其复配后在MRS培养基中防止杂菌生长情况的研究,初步获得了改良MRS培养基。1材料和方法1.1植物菌种培养大肠杆菌(Escherichaecoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantrum)和乳链球菌(Streptococcuslactis):均保存于四川农业大学农产品加工与贮藏工程省级重点实验室;营养肉汤培养基;PDA液体培养基;PDA斜面培养基;MRS培养基;山梨酸(AR级);纳他霉素(食品级,含量50%)。1.2细菌生长特性的测定采用防腐剂稀释平板法测定纳他霉素和山梨酸以及两者复配后对测试微生物的最低抑菌浓度(MIC)。准确称取0.1g纳他霉素于100mL无菌蒸馏水中,配成0.05%的纳他霉素悬浊液,于棕色瓶中存放,现用现配。同时准确称取1g山梨酸溶于20mL无水乙醇,制成5%的溶液待用。测试用细菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌分别用肉汤培养基、PDA液体培养基、PDA斜面培养基、MRS液体培养基进行活化,并制备成106cfu/mL的菌(孢子)悬液。将不同浓度的纳他霉素和山梨酸加至冷却至45℃的定量MRS培养基中,混合均匀,倾注平板,琼脂凝固后即为含不同浓度纳他霉素和山梨酸以及二者混合物的平板。每种菌(孢子)悬液用移液器准确移取5μL接种于含防腐剂的MRS平板上,做3次重复,同时用不含任何防腐剂的MRS平板做空白对照,细菌于37℃、真菌于28℃培养箱中培养24h、48h、72h,观察各种菌的生长情况。以某菌在平板上未生长的最低防腐剂浓度判定为某菌对该种防腐剂的MIC。2结果与分析2.1纳他激素对酵母菌生长的影响由表1可以看出,随着纳他霉素浓度的增加,对霉菌和酵母菌的抑制作用增强,但对大肠杆菌等细菌却没有任何抑制作用。当纳他霉素达到10mg/L时,米曲霉和啤酒酵母的生长受到抑制,而植物乳杆菌和乳酸链球菌的生长良好。因此,纳他霉素对米曲霉和啤酒酵母的MIC为10mg/L。2.2山梨酸达到20cm/l的情况由表2可以看出,随着山梨酸浓度的增大,对大肠杆菌等细菌和真菌的抑制作用明显增强,当山梨酸达到2000mg/L时,除植物乳杆菌和乳酸链球菌外,其他测试杂菌的生长均受到有效抑制。因此,山梨酸对测试的米曲霉、啤酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌菌株均有抑制作用的MIC为2000mg/L。2.3纳他激素对山梨酸复配的协同增效作用单独使用10mg/L纳地霉素能抑制测试的真菌,但对细菌无任何抑制作用;单独使用2000mg/L山梨酸可以抑制测试的常见细菌及真菌的生长。因此,采用2因素3水平的正交试验考察二者复配后的抑菌效果,结果见表3。由表3可以看出,纳他霉素与山梨酸所有组合浓度对测试的乳酸菌的生长均无影响。5mg/L纳他霉素与1000mg/L山梨酸复配时,对枯草芽孢杆菌和米曲霉有抑制作用;5mg/L纳他霉素与1500mg/L山梨酸复配时,除啤酒酵母以外的杂菌均有抑制作用;7.5mg/L纳他霉素与1000mg/L山梨酸复配时,对枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有明显抑制作用,对大肠杆菌和米曲霉有部分抑制效果,但并不能抑制啤酒酵母的生长。除上述外的所有浓度组合都能完全抑制测试的常见细菌和真菌的生长,同时,随着纳他霉素浓度由5mg/L增加到10mg/L,山梨酸的浓度从2000mg/L降低到1000mg/L,均能有效地抑制测试的微生物菌种。试验结果表明,将纳他霉素和山梨酸复配后具有协同增效作用,并且可以降低使用浓度,最佳的浓度组合为5mg/L纳他霉素与2000mg/L山梨酸;7.5mg/L纳他霉素与1500mg/L山梨酸;10mg/L纳他霉素与1000mg/L山梨酸。3山梨酸的抑菌作用据报道,纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母菌都具有抑制作用,但对细菌和病毒则不起作用。研究表明,大多数霉菌被质量浓度为1.0×10-3g/L~6.0×10-3g/L的纳他霉素抑制,极个别的霉菌在质量浓度为1.0×10-2g/L~2.5×10-2g/L的纳他霉素条件下被抑制;大多数酵母菌在纳他霉素质量浓度为1.0×10-3g/L~5.0×10-3g/L时被抑制。试验中纳他霉素对测试真菌的MIC稍微偏高,可能与纳他霉素在微酸性MRS培养基中的抗菌活性受到一定影响有关。山梨酸是一种酸性防腐剂,其抑菌机制主要与其分子态的数量有关,抑菌效果受介质pH值的影响较大。这是由于在酸性环境下它以分子态存在,更易通过微生物细胞膜进入细胞内而起到抑菌作用;而在pH值较高时,多数以离解的状态存在,不易通过微生物细胞膜起作用,抑菌效果受到一定影响。通常山梨酸的最佳抑菌pH值范围在5.6以下,而MRS培养基的pH值为6.2左右,并不是山梨酸的最佳抑菌pH值范围。由于山梨酸不但可以有效抑制霉菌及酵母等真菌,同时对细菌也有一定的抑制作用,所以考虑将山梨酸用于MRS培养基中可抑制部分细菌的生长。魏宝东等(2004年)指出,山梨酸的抑菌效果远不及纳他霉素,仅为纳他霉素的1/50~1/100。试验中山梨酸对测试杂菌均有抑制作用的MIC为2000mg/L,为纳他霉素的200倍,这与山梨酸在微酸性MRS培养基中的抗菌活性较弱有关。同时,实验表明纳他霉素和山梨酸复配后具有协同增效作用,并且可以降低二者的使用浓度。这与SAMPAYO(1995年)报道用纳他霉素和山梨酸钾复配使用可对乳酪起到较好的防腐作用,其原因可能是二者复配后抑菌谱被拓宽所致相一致。国内对于改良乳酸菌培养基有一定的报道,朱宝玉等(2004年)通过向TJA培养基中加入硫酸多粘菌素(10万U/L)和放线菌酮(10mg/L)来改良乳酸菌选择性培养基,改良后的培养基可以抑制除乳酸菌外的杂菌,同时对乳酸菌没有影响;张春辉等(2002年)在研究酒类酒球菌分离培养基时得出,向改良MRS添加50mg/L放线菌酮或100mg/L山梨酸或50mg/L制霉菌素,能够完全抑制酿酒酵母的生长。4纳他激素与山梨酸复配试验中单独添