啤酒废酵母中cuzn-sod的提取与应用

啤酒废酵母中cuzn-sod的提取与应用

sod是超氧化物化学酶的缩写（ecl.15.1.1）。在化妆品市场上，尤其引人注目，如大宝、霞飞、奥琪、隆力奇等名牌都冠之为SOD面蜜。在啤酒行业也有“SOD”啤酒。作为功能性食品基料的SOD，在食品、医药、化妆品等行业愈来愈成为市场的抢手货，需求量大，经济效益显著。目前仅从牲畜动物血中提取，受到原料来源的限制，且质量不稳定。我国啤酒年产量已达2300万吨以上，副产物啤酒废酵母泥也达46万吨左右，倘若从部分啤酒废酵母泥中提取开发SOD，不仅作为商品供应市场，且自产自制SOD啤酒，既不必从外购买SOD，又开发了创新产品增效创收。因此，这是一条利国利民的好路子，本文介绍几种工艺方法供参考。1发酵活性物质SOD是重要的氧自由基清除剂，广泛存在于自然界动植物、微生物中的金属酶。SOD有3种，其中对Cu·Zn-SOD研究得较透彻，人们从技术上已能制造出纯净的SOD产品。现代医学实践证明，SOD对人体超氧负离子自由基（Superoxideanionadicalo2）的氧化性损伤发挥着有效的清除作用和生理效能。因此它能延缓衰老，提高人体免疫力，预防和治疗一些疾病，是最具临床价值的治疗酶。SOD是大分子生物活性物质，我国中医理论素有“药食同源”的说法，SOD经口摄入能否被人体吸收并起到应有的保健作用呢？这方面经研究结果证明还是有效的。因此，仅从功能性食品基料这个市场分析，其良好的效果和应用范围，仍在不断扩大。从啤酒废酵母中提取Cu·Zn-SOD较之从其它动物血液中提取的最大特点是不存在抗原反应，成本低。啤酒企业的管理者可就地取材，产品紧俏，效益可观，何乐而不为呢？2从啤酒中提取sod的一些工艺方法2.1萃取离心法2.1.1工具木的制备将回收的啤酒废酵母泥用2～3倍的无菌冷水（0.5℃～2℃）洗涤，用80目～100目的不锈钢孔板筛过滤，除去酒花树脂等杂质。离心分离后，再用0.5℃～2℃无菌冷水清洗1～2次，直到所得上层清液无色无味，酵母呈纯白色为止。2.1.2萃取剂萃取剂可采用甲苯、乙醇-氯仿、异丙醇等。实验证明其中以“异丙醇法”破壁提取，酵母中SOD的粗提液总酶活力最高，故介绍此法。2.1.3丙酮sod的提取、沉淀及沉淀将预处理过的酵母泥加入异丙醇（异丙醇浓度为90%，酵母泥:异丙醇=9:1），浸泡120min，抽滤出异丙醇。再加入3倍体积50mmoL/L磷酸钾缓冲液（pH=7.0），搅拌120min，离心除去菌体，即得SOD粗提液。用2moL/LHCl调节SOD粗提液至pH=5.0，加入丙酮（温度4℃～10℃，pH=5.0）搅拌均匀为止，使丙酮:粗酶液(v/v)=0.8:1（此时杂蛋白沉淀最多），5000r/min离心，除去沉淀杂蛋白，调节上清液pH至4.0（为SOD的等电点），加丙酮（控制其温度为4℃～10℃），使丙酮:SOD清液(v/v)=0.3:1，此时SOD沉淀的酶比活最高，达3048u/mg。经丙酮2次分级沉淀纯化SOD，回收率达73%，纯化倍数达96倍。2.2分阶段萃取法2.2.1啤酒废水母配方的预处理预处理方法及步骤同2.1.1。2.2.2柠檬酸三钠2h2o甲：0.2mol/L柠檬酸（42g柠檬酸·H2O/L）。乙：0.2mol/L柠檬酸三钠·2H2O(58.8g/L）。甲、乙体积比为0.1:4.5，此混合溶液pH=6.2，再用少量NaAc饱和溶液仔细调整pH至7.4～7.8范围内。2.2.3萃取效率的考察将洗净并预处理过的酵母泥（最好再经过复壮）在充分搅拌下依次地加入原料的0.34倍上述萃取液和1倍量事先备好的6.5%NaCl溶液，剧烈搅拌30min以上，注意pH应维持在7.6，以保证萃取效果，从而保证SOD回收率。2.2.4澄清液充分搅拌上述萃取液，并缓缓加入事先配制好的适量CuCl2饱和溶液（用量比例每100L原料加40gCuCl2饱和溶液）。混合均匀后用水浴加热至68℃，恒温30min，急冷至室温，精细过滤，收集滤液。此时应得到澄清的滤液，不澄清应重新精细过滤。将澄清透明的滤液用少量乙酸钠(NaAc)饱和溶液精细调整其pH为4.8～5.2。置于事先准备好的冰盐水混合浴中，使其冷却到0℃以下，然后在充分搅拌下加入1～2倍丙酮（0℃～4℃）即析出大量沉淀。低温下静置，抽滤得沉淀物后，将其复溶于适量纯水中，仔细过滤除去不溶物得清液。在清液中再加入0.75～1倍体积的冷丙酮，经0℃静置，抽滤得沉淀，真空冷冻干燥即得到呈淡蓝绿色粉末的SOD粗品，比活值可达3000u/mg以上。2.2.5sod的提取粗品SOD溶于pH7.6,2.5mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，经超滤得澄清液，将清液上DEAE-SephadexA-50层析柱(φ7.5cm×40cm)，该柱事先用上述缓冲液平衡，流速应控制在100mL/h～200mL/h。上样至饱和后，用同一缓冲液进行梯度洗脱，流速为100mL/h～120mL/h。仔细地通过取样监测SOD活性的蛋白峰，紫外光吸收的光密度最大值Cu·Zn-SOD为258nm，可见光为680nm。将上述过程中收集的SOD洗脱液装入透析袋中，在蒸馏水中析出盐后，将透析液超滤浓缩，减压冷冻干燥即得到外观带淡蓝绿色的，酶比活达到10000u/mg，分子量（相对分子量）3.2×104，亚基分子量1.6×104的精品SOD。本法较之离心萃取法虽手续繁琐，但不用离心机，收率高，产品质量稳定，经济效益显著。2.3低耗高效技术本法是有待开发的创新技术，膜分离技术是本世纪高科技边缘学科，分离过程中不存在化学反应，可避免物料受热破坏，高效低耗是膜技术的独特优点。SOD是生物大分子的活性物质，分子量（绝对分子量）约5.3123×10-23kg，利用微滤超滤法提取SOD，工艺上具有无相变、低温、活性损失小、回收率高、操作简单等特点。2.3.1提取液的制备将处理过的复壮后的酵母泥在pH偏碱性的条件下，经均质机打成匀浆，加水浸提，将提取液经10um、0.1um膜2次微滤后，去除微小杂质。然后先用1.32808×10-22kg分子量的超滤膜截留大分子物质，收取透过液，再用1.6601×10-23kg分子量的超滤膜截留SOD。2.3.2sod的制备工艺参数：超滤压差0.25MPa～0.3MPa；循环速度以达Re（雷诺准数）>104时，处于稳定的湍流状态；pH为7.5～9.0；浓缩倍数为3～5倍。对浓缩液再进行冷丙酮沉淀，与前述方法雷同。得精品SOD的总酶活力为3000u/mg（邻苯三酚法测定）。膜组体中PVC材质φ65um×250um过滤精度为1um、0.1um微滤膜；截留分子量为1.6601×10-23kg、1.32808×10-22kg；截留率>90%（聚乙二醇-10000-80000）的SPES超滤膜。3酶抑制试验cmp-lkcn以Cu·Zn-SOD为主：分子量为3.