产纤维素酶熟麦曲菌种的筛选及混合制曲工艺优化

产纤维素酶熟麦曲菌种的筛选及混合制曲工艺优化

“小麦酒和酒精饮料”是中国黄酒的一个特点，也是中国黄酒生产中的一种传统操作方法。麦曲作为黄酒酿造的糖化、发酵和生香剂,其品质对曲酒的品质和出酒率都有极大的影响,常有“酒之骨”之称。近几年,黄酒的生产原料(大多为稻米、黍米、玉米、小麦等)受国内和国际粮食市场的影响,黄酒生产的原料成本波动较大,如何提高原料利用率来降低黄酒的生产成本成为黄酒企业日益突出的问题。黄酒主要酿造原料中除含有丰富的淀粉外,尚含一定比例的粗纤维。这部分成分通常不能被α-淀粉酶、糖化酶直接利用,但在相应条件下,可为纤维素酶所分解,并部分转化为可发酵性糖,提高出酒率。然而,根据前期调查研究,浙江绍兴、安徽及上海地区成品麦曲的CMC酶活为0.02～1.10U/g·干曲之间,普遍很低。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β-1,4葡萄糖苷键,使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。目前,研究较多的能够降解天然纤维的微生物主要是木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)等真菌,这类真菌产纤维素酶系较全,能较好地降解天然纤维。本实验室李旺军和张波等人通过对绍兴黄酒麦曲中微生物群落结构的解析及蛋白质组学研究,已筛选分离到了丰富的原核微生物和真菌资源,并初步确定了麦曲发酵过程中功能性微生物主要为真菌类。近年来,国内有不少采用混合菌株进行固态发酵饲料和酱油,以提高产品质量或酶活力的研究。本研究以实验室保藏的108株真菌为出发菌株,结合刚果红平板初筛与制曲复筛筛选高产纤维素酶的菌株。在传统熟麦曲的基础上,将其与米曲霉苏-16(工厂熟麦曲用菌株)混合、优化制曲,提高混合熟麦曲纤维素酶酶活,以期应用于黄酒酿造,提高原料利用率,降低黄酒生产成本。1材料和方法1.1实验用培养基菌种实验室保藏的浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司麦曲中分离筛选、保存备用;小麦轧碎3～4瓣,由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供;米曲霉苏-16由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供;麸皮购于无锡粮油农贸市场;糯米购于无锡大润发超市。斜面保藏培养基纤维素刚果红培养基;酵母膏1.0g、MgS04·7H200.5g、KH2P041.0g、NaCl0.5g、CMC-Na3g、刚果红0.1g、琼脂20g、水1000mL、pH自然,0.10MPa下灭菌20min;产孢培养基麸皮∶水=1∶1,pH自然,0.10MPa下灭菌20min。刚果红(CongoRed)进口分装Sigma公司;羧甲基纤维素钠、测定纤维素酶所用试剂国药集团化学试剂有限公司;PCR所用试剂大连宝生物工程有限公司。UV-2100型紫外分光光度计UNICO(上海)仪器公司;LHS-150SC恒温恒湿培养箱上海一恒科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。1.2菌株鉴定及实验优化1.2.1纤维素酶产生菌的筛选用灭菌的一次性牙签从斜面培养基上挑取少量孢子,点种于纤维素刚果红培养基平板上,30℃培养3d后取出,选择具有透明圈的菌株进行熟曲的制作,步骤如下:1.2.1.1孢子悬液的制备将30℃下培养好的斜面菌种接入装有15g产孢培养基的三角瓶中。30℃培养4d,然后向三角瓶中加入100mL无菌水,充分摇动,用四层无菌纱布过滤制得孢子悬液,以血球计数板计数的方式将孢子浓度调至107个孢子/mL,4℃保藏备用。1.2.1.2熟麦曲制作工艺参照参考文献。1.2.2纤维素酶活力的测定参照参考文献。1.2.3纤维素酶产生菌株鉴定1.2.3.1菌株形态学鉴定菌落形态观察:在PDA平板上划线接种,30℃培养4d,取出观察菌落边缘和表面的质地、颜色等形态;显微镜形态观察:参考乳酸石炭酸棉蓝染色法,在光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及孢子等形态。1.2.3.2菌株分子学鉴定采用氯化苄法抽提真菌总基因组DNA,然后,进行PCR扩增ITS序列,将纯化后的PCR连接转化至感受态大肠杆菌JM-109,挑取阳性克隆子菌液送交上海生工测序部进行测序。获得的测序结果在GenBank数据库中进行相似性检索。1.2.4单因素实验先通过不同菌株的抗性实验,即在同一平板中,将产纤维素酶较高的菌株与米曲霉苏-16交叉画“十”字来观察菌种之间的抗性。然后将产纤维素酶较高的菌株与米曲霉苏-16以不同配比关系制曲,确定用于制备混合熟曲的最佳混合比例,然后依次进行培养时间,含水量和接种量单因子实验。1.2.5响应面实验优化设计实验单因素实验确定中心实验点后进行多因素交互实验,采用Box-BehnkenDesign(BBD)优化混合熟曲产纤维素酶工艺条件。实验因素与水平设计如表1所示。1.2.6小型黄酒酿造实验浸米:28℃保温条件下浸米2～3d;蒸饭:待上汽后蒸饭25min左右,保证米饭蒸熟无生心;拌曲:摊凉至室温,拌曲接种(配方:糯米∶水为1∶1.8,麦曲为糯米量的17%,速酿酒母11.4%);发酵:30℃主酵3d,每天搅拌2次;15℃后酵12d。1.2.7黄酒中理化指标的测定测定发酵结束后黄酒的酒精度、总糖、(-氨基氮、总酸等理化指标。2结果与分析2.1不同菌株对熟麦曲产纤维素酶活力的检测以工厂制备纯种熟曲用菌种米曲霉苏-16为对照,通过刚果红平板从108株保藏菌种中筛选得到8株能够产生透明圈的菌株(编号分别为CF1,CF2,CF3,CF4,CF5,CF6,CF7,CF8),将上述菌株分别制作熟麦曲,然后测定纤维素酶活力,重复3次取平均值,结果见表2。由上表可知,菌株CF7制成熟麦曲产纤维素酶活力均高于其它菌株,并且是对照菌株米曲霉苏-16产纤维素酶活力的2.9倍。因此,选择菌株CF7作为双菌种混合制曲菌种以进一步实验研究。2.2sahse-sas-pcr扩增由图1可以看出,PDA培养基上菌丝初为白色、绒毛状,菌落中间隆起,向四周辐射稀疏生长;菌落中央菌丝渐变为黄灰色,异常厚密;后菌丝变为灰黑色,产生黑色孢子。光学显微镜形态显示,具有曲霉属典型的顶囊、小梗以及分生孢子。结合ITS基因序列同源性分析,结果表明:菌株CF7的ITS序列(图2)与Aspergillusniger(JN676125)同源性高达99%。因此,初步判定菌株CF7为曲霉属中的黑曲霉(Aspergillusniger)。2.3单因素流制度的结果2.3.1不同配比产酶的产酶结果将筛选得到的菌株CF7与米曲霉苏-16混合制曲,接种前先将孢子悬液按比例混合并震荡均匀,每50g蒸熟小麦接种混合好的孢子悬液3.0mL,于30℃、相对湿度为90%～95%条件下培养相同时间。通过测定混合熟曲产纤维素酶的情况,确定用于制曲最优的混合比例(见图3)。可以看出,当黑曲霉:米曲霉苏-16配比为8∶2时,产纤维素酶酶活最高,比单独培养黑曲霉或米曲霉苏-16有明显优势。此外发现,制曲中只要混合有黑曲霉,制成的熟曲纤维素酶酶活均远高于米曲霉苏-16,但除了配比8∶2外,其他配比产酶都弱于单独培养黑曲霉。这可能原因是黑曲霉与米曲霉苏-16之间存在一定的相互作用,因为通过十字交叉法(图4)发现,黑曲霉与米曲霉苏-16两株菌交叉区域,后者比前者长势略好,表示两株菌之间有一定抗性。2.3.2不同培养时间对产纤维素酶活性的影响培养温度为30℃,培养箱相对湿度设定为90%～95%,接种量为3.0mL,研究培养时间对混合制曲产纤维素酶的影响(见图5)。由图5可知,随着培养时间延长,混合熟曲纤维素酶活性逐渐升高,在48h时达到产酶高峰,比单独培养黑曲霉提前了4h,随后延长培养时间,纤维素酶酶活迅速降低。此外,单独培养米曲霉苏-16在20h时产纤维素酶为零而混合熟曲产酶已经比较可观了,由此也验证了黑曲霉与米曲霉苏-16混合配比是合理的,并且混合培养产纤维素酶比纯种培养具有优势。因此,最佳培养时间为48h。2.3.3原料含水量对纤维素酶活性的影响培养温度为30℃,相对湿度设定为90%～95%,接种量为3.0mL,培养时间为48h,研究原料含水量对混合制曲产纤维素酶的影响,由于原料小麦蒸熟后本身含水量已经达到40%,所以设置变量范围为40%～90%。原料含水量对纤维素酶酶活的影响见图6。由图6可知,原料含水量对纤维素酶活性影响明显,当含水量低于60%时,纤维素酶酶活逐渐增高,当含水量为60%时,纤维素酶达到最大值,之后随着含水量的增加不断降低,在含水量达到90%时,纤维素酶酶活急剧降低,这是由于超过霉菌生长最适含水量后,含水量越大,会在原料表面形成水膜,阻碍了空气与原料的接触,导致霉菌的生长因供氧不足而受到抑制。因此,选择原料含水量为60%为最佳条件。2.3.4接种量对纤维素酶活性的影响培养温度为30℃,相对湿度设定为90%～95%,培养时间48h,原料含水量为60%,研究接种量对混合制曲产纤维素酶的影响(由于接种量较大,故将其折算入含水量计),接种量对纤维素酶酶活性的影响见图7。由图7可知,随着接种量的增大,纤维素酶酶活不断增加,当接种量为3.5mL时,达到最大值为28.6U/g·干曲;当接种量大于3.5mL时,由于菌体生长受到底物营养环境的制约,以及更多的营养物质用于自身生长消耗,故混合熟麦曲产纤维素酶有所下降。因此,实验较佳接种量为3.5mL(相当于7×105个孢子/g原料)。2.4回归模型的建立与分析由单因素实验结果可知,培养时间、含水量和接种量对混合制曲产纤维素酶影响较大,因而按表3进行3因素3水平响应面设计与分析(DesignExpertsoftware7.0.0),实验结果见表3。混合制曲产纤维素酶3D响应面如图8所示。图8形象直观地给出了各个因子交互作用的响应面和等值线分析图。由图可以看出,培养时间、含水量和接种量对纤维素酶活力都有影响,且在所选范围内均存在极值,特别是培养时间与接种量的交互作用影响较大,在响应曲面图中表现为曲面坡度大,变化明显。从表4可看出,模型的p<0.01,说明模型极显著;失拟项的p=0.0526,无显著影响,说明模型拟合较好,无需引入更高次项,模型可行。另外,模型的校正拟合度R2AdjAdj2=99.38%,变异系数C.V.%=1.16%,信噪比为53.3,表明该模型可以用于解释实验设计及结果。混合制曲产纤维素酶对培养时间(A)、含水量(B)和接种量(C)的二次多项回归方程为:CMC酶=29.08+2.28A+2.81B+1.71C+1.00AB+1.00AC-1.58BC-2.28A2-3.40B2-1.30C2。求得最佳培养条件为培养时间50.9h、含水量61.8%、接种量3.9mL,预测纤维素酶的最大酶活力为33.0U/g·干曲。2.5混合制曲产纤维素酶酶活情况为了验证预测值,采用上述最优培养条件(实际实验过程中培养时间取51h、含水量取62%、接种量3.9mL)重复实验三次,实际测得混合制曲产纤维素酶分别为:32.5、33.1、31.9U/g·干曲,平均为32.5U/g·干曲,是工厂单一菌种熟麦曲产纤维素酶酶活的29.5倍。实际值与预测值有较好的拟合性,说明该模型可以较好地反映混合制曲产纤维素酶的条件,具有可行性和参考应用价值。同时,测定了混合熟麦曲α-淀粉酶酶活平均为29.8U/g·干曲,糖化酶酶活平均为997.4U/g·干曲,酸性蛋白酶酶活平均为477.8U/g·干曲,三种酶酶活力与单一菌种熟麦曲相近。2.6小型黄酒处理2.6.1后酵阶段二氧化碳失重图9显示了小型黄酒发酵过程,以添加实验室自制单一菌种熟曲为实验对照组。由图可以看出,主酵期混合熟麦曲黄酒发酵二氧化碳失重明显高于对照组,发酵强劲。进入后酵阶段,二氧化碳失重均趋向平稳,但仍保持一定优势,当后酵结束二氧化碳失重最终达43.69g,比对照组多1.79g。分析原因:混合熟麦曲中纤维素酶将原料中部分纤维素降解为可发酵性糖;纤维素酶对原料细胞壁的破坏,释放出胞内淀粉等物质,协调其他酶对原料分子链分解,将淀粉质原料较多的转化为酵母可利用的糖,促进了酵母的生长。2.6.2提高了酒精产率表5是发酵结束后黄酒的几项主要指标,可以看出,两种麦曲酿造的黄酒各项理化指标均正常。在相同的发酵时间内,混合熟麦曲在一定程度上提高了酒精的产率,相对单一菌种熟曲酒精产率提高了6.1%。另外,发现混合熟曲发酵醪液过滤速度远快于单一菌种熟曲发酵醪液过滤速度,这可能是纤维素酶能够改进淀粉的利用程度和非淀粉碳水化合物的水解,有利于降低发酵液粘度的缘故。3次多项式数学模型的建立及验证3.1在粮食短缺的今天,提高粮食利用率是企业生存、适应、发展的根本。本研究持着“取之于曲,用之于曲”的理念,着眼于“提高原料利用率”的目标,从实验室保藏的麦曲微生物中筛选到1株产纤维素酶较高的真菌CF7,经菌株形态和ITS基因序列初步鉴定为黑曲霉(A.niger)。3.2在单因素实验的基础上,利用实验设计软件Designexpert,采用RSM法建立了优化黑曲霉与米曲霉苏-16混合制曲产纤维素酶工艺条件的二次多项式数学模型,研究分析了培养时间、含水量以及接种量对响应值的影响。实验结果表明:模型拟合程度高,实验误差小。当黑曲霉与米曲霉苏-16以8∶2的比例混合接种时,实际实验最优