丹参中酚酸类成分的测定及其方法学考察

丹参中酚酸类成分的测定及其方法学考察

丹参最早出现在《神农本草经》中，并列为优秀。这是嘴唇科植物的丹参saltioragilnigaidale。干燥的根和根茎可以消除淤血、疼痛、活血、净化和摆脱悲伤。其有效成分分为脂溶性、水溶性两部分,前者主要含有二萜类化合物,后者则为酚酸类化合物。研究发现,丹参中的水溶性酚酸类成分主要有丹参素(danshensu)、原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)、丹酚酸A(salvianolicacidA)、丹酚酸B(salvianolicacidB)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、紫草酸(lithospermicacid)、丹酚酸D(salvianolicacidD)和丹酚酸E(salvianolicacidE)等。现代药理研究亦证明,丹参酚酸类成分具有改善微循环、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脉流量及心肌供氧量等作用,是丹参祛瘀、活血的主要活性成分。2010年版《中国药典》仅以丹酚酸B为其水溶性成分的检测指标,尽管丹酚酸B含量较高,但仍难以真正体现和保障丹参的内在质量,传统中医的整体观要求对中药材进行多药效成分指标的综合评价。由于丹酚酸B的结构特点,其化学性质极不稳定,长期以来一直面临对照品难得、货源严重紧缺和检测成本昂贵的问题。那么,如何在对照品供应不足或缺省的情况下实现对中药丹参水溶性成分的整体控制,是目前中药丹参质量控制中亟待解决的关键问题和技术标准难题。“一测多评”(quantitativeanalysisofulti-componentsbysingle-marker,QAMS)技术为解决这类问题提供了一个可供选择的方法,这一模式已被2010年版《中国药典》一部收载。本文重点探讨了“一测多评”法在丹参酚酸类成分多指标质量评价中的技术适用性和可行性。1材料表面1.1管阵列分离器WatersAlliance高效液相色谱仪,包括2695溶剂管理系统,2996二极管阵列检测器,Empower2色谱工作站(美国WATERS公司);ShimadzuLC-20A高效液相色谱仪,包括LC-20AT溶液传输单元,SIL-20A自动进样器,SPD-M20A二极管阵列检测器,LCSolution色谱工作站(日本岛津公司)。1.2药品化学品检定所需药物有丹参素钠(批号855-200102),原儿茶醛(批号110810-200506),迷迭香酸(批号111871-201001),丹酚酸B(批号111562-200807)均购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用;紫草酸购自南京泽朗医药科技有限公司,纯度均>98%。1.3唇形科植物麻黄tiorrhiz的干燥丹参市售饮片购自各地药材商店/市场,经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为唇形科植物丹参S.miltiorrhiza的干燥根及根茎。1.4试剂甲醇色谱纯,水高纯水,其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.11个研究评估的方法论2.1.1流动相a-3%苯甲酸水溶液b/a流动相,cXtimateTMC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈(A)-3%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,0~80min,0%~33%A,流速1mL·min-1,柱温30℃,检测波长280nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于6000。见图1。2.1.2续滤液的制备取丹参粉末(过40目筛)约0.5g,精密称定,置滤纸包中,精密称定,置100mL圆底烧瓶中,精密加入纯净水50mL,称定质量,置电热套(250W,150℃)中加热回流2h,取下,放冷,再称定质量,用纯净水补足减失的质量,摇匀,用0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液,备用。2.1.3对照品溶液配制精密称取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B对照品各约4.00mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,配成浓度约为0.4g·L-1的混合对照品溶液1#,备用。分别精密吸取上述混和对照品溶液1.5,1.0,0.5,0.25,0.125,0.06,0.03,0.003mL置2mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液2#~9#(质量浓度分别约为①0.400g·L-1,②0.300g·L-1,③0.200g·L-1,④0.100g·L-1,⑤0.0500g·L-1,⑥0.0250g·L-1,⑦0.0120g·L-1,⑧0.00600g·L-1,⑨0.000600g·L-1)。2.1.4线性回归高效液相色谱法分别精密吸取2.1.3项下9个浓度的混合对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪。以测得的响应信号(峰面积)和被测物的量,用最小二乘法进行线性回归,得到各成分的回归方程以及线性范围。结果表明:丹参酚酸混合对照品溶液在如下范围内成良好的线性关系,结果见表1。2.2同时测定丹参酚酸phlc的方法研究2.2.1方法的精密度和准确度取同一份丹参供试品溶液于同1d和3d内重复进样,测定丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5个酚酸类成分的峰面积,计算RSD。结果日内精密度,各成分峰面积的RSD分别为0.42%,0.43%,0.50%,1.0%,0.57%;日间精密度各成分峰面积的RSD分别为0.67%,0.64%,0.59%,0.78%和0.86%,表明仪器的精密度良好。2.2.2药材含量测定取同一批丹参药材粉末(过40目筛)约0.5g,精密称定,按2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液,测定峰面积,计算药材含量及RSD。结果测得丹参中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5个酚酸类成分的含量分别为0.351%,0.0215%,0.191%,0.231%,3.53%,RSD分别为3.5%,2.2%,1.6%,3.3%和2.0%,表明该方法的重复性良好。2.2.3rsd测定取同一份丹参供试品溶液,分别于样品制备后的第0,1.5,3,4.5,6,7.0,9,12,18,24,36h进样,测定峰面积,计算RSD。结果丹参中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5个酚酸类成分峰面积的RSD分别为0.44%,1.3%,0.44%,0.86%,0.70%,表明36h内,供试品溶液的稳定性良好。2.2.4加样回收率试验取已知含量的丹参粉末约0.25g(丹酚酸B加样回收率取丹参粉末0.025g)(过40目筛),精密称定,平行6份,分别按药材含量-对照品(1∶1)的比例加入一定量的对照品溶液,按2.1.2项下方法制备供试品溶液,测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5个酚酸类成分的加样回收率分别为100.2%,99.9%,99.9%,100.3%,101.6%,RSD分别为0.41%,0.66%,1.5%,1.0%,1.1%,表明该方法的准确度良好。见表2。2.3相对校正因子的确定2.3.1不同待考物的相对校正因子及前因子计算以丹参素钠为内参物,根据相对校正因子计算公式,分别计算各待评价成分原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B与内参物丹参素钠的相对校正因子,见表3。2.3.2抗省法的适用性和系统适应性的评估针对可能影响相对校正因子重现性的一些因素,设计了一系列实验,重点考察不同实验条件对相对校正因子重现性的影响。2.3.2.种高效液相色谱对人参酚酸相对校正因子的影响试验在不同实验室进行,采用XtimateTMC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,分别考察了2种不同的高效液相色谱系统对丹参酚酸相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子重复性良好(RSD<5%)。见表4。2.3.2.色谱柱对人参酚酸相对校正因子的影响试验在同一实验室进行,采用WatersAlliance和ShimadzuLC-20A2种不同的高效液相色谱系统,分别考察了4种不同型号规格的色谱柱对丹参酚酸相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子重现性良好(RSD<5%)。见表5,6。2.3.2.相色谱条件对人参酚酸相对校正因子的影响试验在同一实验室进行,采用WatersAlliance高效液相色谱系统和XtimateTMC18色谱柱,分别考察了不同流速(1.0,1.1mL·min-1)对丹参酚酸相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子重复性良好(RSD<5%)。见表7。2.3.2.色谱柱温度的确定试验在同一实验室进行,采用WatersAlliance高效液相色谱系统和XtimateTMC18色谱柱,分别考察了不同柱温(35℃和30℃)对丹参酚酸相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子重现性良好,见表8。2.4相对保留值和保留时间差法“一测多评”法色谱峰的准确定位一般可以采用保留时间差或相对保留值等参数结合色谱图整体特征,以及每个峰的紫外吸收特征来定位其余待测成分(a,b,…,i,…)色谱峰。相对保留值指各待测成分与内参物s间保留时间的比值,计算公式:ras=tRa/tRs;保留时间差指各待测成分与内参物S间保留时间的差值,计算公式:ΔtRas=tRa-tRs。本研究分别考察相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性。结果表明相对保留值的波动较为明显,RSD>5%,不太适合作为待测成分色谱峰定位的依据,保留时间差的波动相对较小,因此采用保留时间差法进行丹参中酚酸类待测成分色谱峰的定位较为可行。见表9,10。2.5酚酸类物质的测定首先采用外标法对丹参中5种酚酸类成分进行多成分同步含量测定,再用建立的QAMS法对其含量进行计算,并将2种方法计算的结果进行比较,以验证QAMS法用于酚酸类多指标成分质量评价的准确性。结果表明,2种方法测得的丹参酚酸类成分含量没有显著性差异,相对偏差<5%,提示建立的方法具有较好的可信度。见表11。2.6计算含量测定另取丹参样品10批,按照QAMS法进行含量测定,利用所建立的QAMS法进行10批丹参样品的实际测算,得到其含量计算值;然后再以多成分同步测定方法(外标法)进行反证,进一步验证QAMS法的合理性。2种方法测得的酚酸类成分含量无显著性差异,相对偏差<5%,表明建立的QAMS法在丹参酚酸类成分检测中的适宜性良好,可用于标准的起草与制定,见表12。3相对校正因子的确定检测波长的选择采用二极管阵列检测器,在190~800nm波长下对供试品溶液和对照品溶液进行了全波长扫描,并对相应吸收波长下的供试品色谱图进行了分析,结果在270~290nm波长下丹参五种酚酸吸收峰均为最大吸收,且色谱峰分离度良好,全部达到基线分离,各待测成分色谱峰纯度角均小于纯度阈值,表明各色谱峰内无杂质干扰。故采用280nm作为检测波长。相对校正因子重现性本试验选用化合物性质相对稳定,对照品相对易得且价廉的丹参素钠为内参物,建立该成分与其他4种酚酸类成分间的相对校正因子。通过对30余批丹参药材与饮片的测定,验证了该色谱方法的精密度、重现性、稳定性、系统适应性和QAMS法的准确性,并对QAMS法的适用性和可行性进行了探讨研究。结果表明,QAMS法推算的含量与实测法所得含量没有显著性差异,提示试验建立的相对校正因子具有较好的可信度。丹参含量测定结果显示,药材中丹参素与原儿茶醛,迷迭香酸,紫草酸及丹酚酸B的相对浓度比分别约为20/1,3/1,2/1及1/10,因此在对丹参酚酸相对浓度比约为1/1的条件参数进行相对校正因子考察的同时,还根据药材中酚酸类成分的不同相对浓度比的条件参数对其相对校正因子进行了考察,结果原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B与丹参素钠的相对校正因子分别为6.896,2.927,1.657,1.748,2种条件参数下的相对校正因子进行比较,相对标准偏差小于5%,表明不同相对浓度比条件下丹参酚酸的相对校正因子之间无显著性差异。QAMS法待测色谱峰的定位在本研究中通过考察相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性,选择保留时间差作为色谱峰定位依据。由实验数据见表10的统计中可以发现,不同型号的色谱柱对原儿茶醛的选择性较强,相对标准偏差略大于5%,而对其余成分的选择性相对较弱,相对标准偏差均在2%左右波动。因此为了保证QAMS法待测色谱峰的准确定位,可参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定,对试验所需色谱柱型号和规格进行规定,即可获得满意结果。实验中建立的丹参酚酸同步测定的方法同样适用于丹酚酸A,但是由于丹酚酸A自身化学性质不稳定,重复性试验相对标准偏差较大,因此未对其进行回收率试验。试验中发现丹参的供试品溶液在样品制备后9.5h内、对照品溶液24h内丹酚酸A含量相对稳定,因此在考察上述丹参酚酸类成分间相对校正因子的耐用性和系统适应性的同时,也对丹酚酸A与丹参素钠间的相对校正因子进行了考察,结果显示其相对校正因子(f丹酚酸A/丹参素钠=4.254,RSD