中药质量标准体系构建的科学方法

中药质量标准体系构建的科学方法

《国家药物安全“十二五”计划》明确指出了“中国标准主导基准”的制定。这一目标的提出表明我国已经开始从国家层面重视中医药的发展,开始把握中药国际标准制订的主导权,将推进“中药标准化和现代化”纳入了新时期的重点战略任务,从而推动中药国际化发展。我国一直重视中药质量的标准化工作,《中国药典》每5年修订1次,每年制订1个增补版,这在很大程度上提升了我国药品质量标准的水平和相对保障了中药实用的安全和有效。2010年版《中国药典》收载了4567个品种,基本形成了中药材、中药饮片、中成药、化学药品、药品辅料、生物制品等门类齐全的药品标准体系。然而到目前为止,我国尚未有处方药真正获得国外市场尤其是欧美市场的认可,中药往往是以保健品或者食品补充剂的角色出现在欧美市场。因此在推进我国中药国际化的进程中,中药标准引领国际需先行,通过构建完善的中药质量标准体系,让中药在欧美市场以药品的形式获得国际认可。标准体系构建的方法却一直是仁者见仁,智者见智。如肖小河教授［1］提出了中药质量控制和评价模式应多元化,提出在质量标准中采用生物效价检测方法;梁鑫淼教授［2］提出了中药质量控制技术应重点发展以分离和表征技术为主的中药质量控制关键技术,构建具有中药特色的过程控制和产品质量控制标准。毋庸置疑,这些创新的方法为中药质量标准体系的构建与完善提供了更多的思路。但是中药标准构建一方面需要先进的科学技术,前沿的研究成果,同时更需要在实际应用中具有可操作性,所以很多新的方法应用到标准中还需要大量的实践与验证。美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典(BP)等国家官方机构都收录了多个传统草药或植物药的标准,据笔者实验室最新统计,2014年出版的美国药典37中收录有153个草药及其制剂,欧洲药典8.0中,收录有272个草药及其制剂。各国药典委员会在参考《中国药典》英文版的同时,并根据本国的实际情况对草药质量标准进行制订和管理。以专论(monograph)体现的思路与理念,形式和内容,不同的国家也不尽相同。奥地利国家中医药研究中心主任RudolfBauer教授与欧洲药典会中药专家委员会主席GerhardFranz博士在他们的文章中详细对比了2005年版《中国药典》与欧洲药典6.0的异同［3］。但应该看到标准制订的思路与理念是相通的,在基本指导思想上是可以互相借鉴与学习,以便达成共识。这些专论为我国中药质量标准体系的国际化提供了可以学习和借鉴的方法。中药质量标准体系构建主要包括2部分工作:基础研究与标准建立。实用的中药质量标准需要方法科学、多点控制、实用可行,只有深入地进行大量的基础研究工作与积累总结,才有简便而又严谨的标准,只有足够地“深入研究”才有合适地“浅出标准”。1深入研究中药标准体系的构建首先要进行深入地基础研究。1.1关于药材质量判断标准中药品种的基原确定是中药质量标准构建的根本。从《中国药典》收载的中药的基原背景,已可看出中药品种的复杂性。考虑到历史沿革和药材资源的问题,中药多基原的情况一直存在。完善的质量标准首先要对中药优质品种进行发现和确立,尽可能的单品种、单基原,以保证所使用药材疗效的一致性。中药质量标准的发展进程也是对生物多样性选择性应用的过程。《中国药典》已经在这方面做了很多研究工作,将所含成分差别较大的品种按照一物一名的原则分列。如将葛根项下的野葛与粉葛分列2个项下,对于葛根素的限度进行了分别要求;将五味子因其性状和有效成分的不同列为五味子与南五味子2个品种;将漏芦分为祁州漏芦和禹州漏芦;将川黄柏与关黄柏分开,并分别进行了定量控制等等。但是也有学者对有些品种的分列提出质疑,如金银花与山银花的分列,以木犀草苷作为指标成分分列的依据是否充分,原植物忍冬作为金银花的唯一来源给金银花市场资源可能带来的困扰等类似问题其实也存在于一些其他品种中,这就需要大量深入的基础研究后才能得出科学恰当的结论［4］。中药基原的复杂性为药材的真伪鉴别与优劣评价工作带来较大难度。现已有许多新技术、新方法应用到实际研究工作中,从细胞学、化学、分子生物学等多角度对中药品种进行鉴定。近红外漫反射光谱技术与聚类分析方法相结合,快速准确识别伪劣药材已经得到广泛推广。DNA分子鉴定技术已经在2010年版《中国药典》中应用于乌梢蛇极其混淆品种鉴别中,这个方法可以广泛应用于其他动物药如鳖甲、海马的鉴别中。跨学科的合作,让在继承基础上的创新能够得以实现。天然麝香、市售麝香及人工麝香的谱图相似性较高,尤其是人工麝香与天然麝香极其相似,难以区分;采用傅里叶变换红外(FTIR)光谱法并结合二阶导数技术,提高了谱图分辨率,可直观有效地鉴别正品麝香。该方法具有快速、灵敏、直观、无损等特点,可为名贵药材的来源与真伪鉴别提供了新的手段［5］。1.2多成分认识的不断深化基于中医理论指导下的全面药效物质基础研究是中药质量标准体系构建的的基石。中药是多成分的复杂体系,进行全面质量控制不宜做到,目前能做到的就是基于中医理论指导下去认识中药的主要药效成分,基于中医理论指导对药效物质基础进行全面的研究。《中国药典》中的中药标准与国外植物药专论最显著的特点也是最重要的区别就是中药标准定性与定量的成分确立依据离不开中医临床的功能主治。而植物药则是孤立地就已有的化学研究基础进行标准的构建。众所周知,中药质量标准体系建立的初期主要是参考化学药物的质控模式,孤立的去构建某一个指标性成分的定性定量标准,从而对整个中药进行质量控制。但是中药复杂体系与化学药的单一成分完全不同,构建这样的标准体系只能是中药质量标准构建进程中的过往与历史。拥有多成分与多靶点起效的中药需要更加完善的整体质量标准体系。这就是整体观,也是基于药效作用的多成分的分离与定性定量分析。在通过对更多成分认知的过程中,逐步完善整体质量控制标准体系的构建。如笔者所在实验室通过对白芍的化学成分进行分离,从白芍中提取分离到了新化合物芍药苷亚硫酸酯,并明确了该化合物是白芍硫磺熏制的过程中由芍药苷和二氧化硫反应而生成,并提出控制芍药苷亚硫酸酯的限量。由此可见深入的基础研究可以帮助中药从炮制、加工开始就得到严格有效的质控。笔者实验室通过化学手段对同属不同种植物进行分离研究,发现了其间的显著性差异,如《中国药典》中灵芝项下收载的赤芝Ganodermalucidum和紫芝G.sinense,如果仅就多糖类成分进行研究,它们几乎是相同的,但进一步对三萜类成分研究发现赤芝和紫芝有很大的区别。赤芝的代表性成分灵芝三萜酸、灵芝三萜烯酸、灵芝醇等成分在紫芝中几乎检测不到［6］。而很多研究显示灵芝三萜类化合物具有很好的药理活性［7-8］。但是在药典中,还一直将2种灵芝都作为中药灵芝的合法来源。因此建议,灵芝项下收载的赤芝和紫芝2个品种由于差异性较大,临床应用时还需要仔细甄别,区别使用。1.3关于中药单体、中药提取物的研究中药作为复杂体系,作用机制的研究在以中医理论为指导的同时,还需要多学科共同研究,彼此渗透交叉,并通过多种技术进行辅助、得到尽可能多的信息数据,进行多角度分析。许多全新的想法与技术在不断酝酿,其中比较突出的是系统生物学技术应用到中药的研究中。系统生物学主要包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学、生物信息学等各种组学,它对人体从生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成及其在特定条件下这些组分之间的相互关系的研究,系统生物学的整体观与中医药复杂体系的整体观在某种程度上达成契合,让很多科研工作者更有兴趣进行深入研究。近年来,笔者实验室也一直在进行该方面的研究,将蛋白组学、生物信息学应用到中药单体、中药提取物研究中,已经对丹参、三七、灵芝的提取物进行了相关研究工作［9］。通过蛋白质双向电泳结合质谱鉴定的方法找到了12个可能与灵芝孢子总多糖(polysaccharides)刺激小鼠脾脏单核细胞增殖作用相关的蛋白质［10］;通过蛋白质双向电泳结合蛋白质功能验证等技术阐明了灵芝总三萜(ganodermatrit-erpenes)与抗肿瘤化学药物阿霉素合用对人宫颈癌细胞株HeLa的细胞毒性的分子机制,其协同作用机制可能是通过增加氧自由基损伤和DNA损伤以及诱导细胞凋亡杀死肿瘤细胞［11］。中药丹参中的主要活性成分丹酚酸B的作用机制,受到广泛关注,实验室研究发现［12-14］丹酚酸B可对心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心肌纤维化、慢性心衰等皆有显著保护作用。在细胞水平,丹酚酸B明显降低血小板聚集、改善心肌细胞和心肌成纤维细胞的抗缺氧能力、降低血管平滑肌细胞的通透性、降低心肌成纤维细胞的迁移和胶原分泌能力;在分子水平,课题组研究证实丹酚酸B是一个新型的MMP-9抑制剂,可与intergrin直接结合等,上述研究拓展了丹参研究的深度也为制订科学合理的丹参质量标准提供了科学依据。此外,课题组采用生物信息学反向对接的方法寻找丹酚酸B的直接结合蛋白靶点,用蛋白质组学的方法寻找丹酚酸B作用的信号传导靶点,随后用生物信息学网络分析的方法将靶点形成网络并进行验证［15-16］。上述研究拓展了丹参研究的深度,也为制订科学合理的丹参质量标准提供了科学依据。迄今为止,不少科研工作者都在系统生物学思路指导下开展了对中药复杂体系的研究,但是全新的技术如何能全面、系统、正确地阐明中药的作用靶点、作用环节和作用过程还有很长的一段路要走。2制订标准要科学、与简单地联系起来中药标准体系的构建在深入的基础研究之后,立足点还要落在制订的标准要科学、相对简单并可行。根据在实验中遇到的问题与积累的经验,在现有质量标准指导原则的基础上,对中药整体质量控制标准研究的思路与方法提出以下几点建议,以供商榷。2.1通过标准对照提取物进行筛选对照物质在标准的构建与执行过程中扮演着重要角色。在实验研究中,经常会遇到用于定性的对照药材缺货或者买到的对照药材不同批号在薄层鉴别中表现不同,用于定量的对照品含量经常低于90%,这一问题为标准的构建工作带来很大困扰。在实验室大量的实践工作中发现,对照提取物的应用以及一测多评方法可以更好地帮助解决这一问题。标准对照提取物的制备比对照品(referencestandard)更易获得,经济实用;同时又比用对照药材制订的标准更严谨,批与批之间易保证良好的一致性,在相同的色谱条件下,色谱行为重现性好。在《中国药典》,对照提取物仅应用于以该提取物为原料药制备的制剂中。实际上对照提取物在药材的鉴别上同样适用。对于多基原的品种及一个中药中含有不同类别的成分,通过制备相应的对照提取物同样可以制订科学可行的质量控制标准。提取物制备的工艺过程可以是开放式的,不用条条框框去限定,不要成为标准制订的瓶颈,可以殊途同归,但最后还是都要归结到符合相应的质量标准上。所以要求提取物的标准要尽可能地周详与严谨,通过结果控制过程。在美国药典植物药的专论中,标准对照提取物的使用贯穿于整个标准的定性、定量研究。在定性研究中,采用标准对照提取物进行薄层鉴别中条带(或斑点)以及特征图谱中特征峰的指认。在定量研究中,采用标准对照提取物在一测多评方法的应用中帮助进行非对照色谱峰的其他峰指认。美国药典与欧洲药典都采用终产品质量控制的方式,提取物的制备过程及方法在标准中表述的比较简单。美国药典的提取物与制备相关的内容主要包括3大元素:提取所用生药,合适的溶剂以及标示量(或含量)。例如,Echinaceapallida提取物,在表述上为:采用醇水混合溶剂或其他合适的溶剂对E.pallida的根进行提取;生药与所得提取物的比例为2∶1~8∶1;本品按干燥品计算,含总酚以咖啡酰酒石酸(caftaricacid),菊苣酸(chicoricacid),绿原酸(chlorogenicacid)以及松果菊苷(echinacoside)之和计,应为4.0%~5.0%。在欧洲药典中,也是类似的情况,如欧洲药典6.1中银杏提取物的标准中,该部分内容是从3个方面进行描述:定义(包括含量)、生产过程以及性状。在生产过程(produc-tion)项下的描述中,提取物是由银杏叶精制而成,采用合适的过程,提取溶剂为有机溶剂或与水混合成一定比例,采用合适的物理分离过程。在制备方法中少了我国药典中的提取时间、次数、提取溶剂及所用倍量等等,而对于这些细节上的要求,其实是通过严格的质量标准来进行控制。总之,新的对照物质、对照提取物的广泛应用可以帮助更经济更科学的构建中药质量控制标准。2.2标准对成分的定性鉴定中药标准体系的构建离不开薄层图谱、特征图谱或指纹图谱,他们将中药标准采用图谱的形式生动直观的展现出来,让标准简单清晰的表达出来,更容易被接受和理解,这是“深入研究,浅出标准”这一理念的最好表现形式。2.2.1薄层图谱目前《中国药典》中药标准中,在鉴别项下大多以显微鉴别和薄层鉴别为主,在薄层鉴别中,大多品种仅仅要求与对照药材一致,没有标明所含成分,没有明确检测几个斑点。但在实际工作中,需要对更多的成分进行检识,以便更好的监控中药的真伪和优劣,所以建议对于薄层鉴别图谱进行细化和完善。如丹参在《中国药典》中,只分别对丹参酮ⅡA、丹酚酸B以及对照药材进行鉴别,笔者实验室对该标准进行了修订,该部分的工作体现在美国药典37版第4卷收载的丹参药材标准中［17］,表述如下:日光下,供试品色谱图中,在薄层板上1/3部分,在Rf约为0.75的位置,与丹参酮ⅡA对照品色谱相应的位置上,显相同的粉红色斑点。供试品色谱中,在Rf约为0.65和0.50的位置上还分别有1个黄白色斑点和1个橙色斑点,与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,分别由丹参酮I和隐丹参酮产生。紫外光灯下(365nm),供试品色谱图中,在薄层板下1/3部分,在Rf约为0.20的位置,与丹酚酸B对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝色荧光斑点。供试品色谱中,在Rf约为0.30和0.35的位置上还有2个斑点,与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,分别由紫草酸和迷迭香酸产生。修订后的标准不仅明确了丹参酮ⅡA、丹酚酸B2个成分,同时还通过Rf及斑点或条带的颜色来指认对照药材色谱上相应的位置上的成分,将丹参中目前含量较高的6个活性成分均予以指认。在美国药典与欧洲药典中,即便不知道条带(或斑点)归属的化学成分,也会对条带进行详细的描述,要求在鉴别中进行检识。如美国药典中刺五加(eleuthero)的薄层鉴别中,除了对对照品刺五加苷B(eleutherosideB)进行描述为棕色至红色条带外,又分别对其上下的蓝色条带和黄色条带进行描述,同时还描述在薄层板的上部有若干棕色至黄色条带。欧洲药典在标准中是采用了更直观的与薄层板对应比例的图表,在相应的位置写上条带的颜色,如银杏提取物中,条带的表述有8条,大约十余个成分在表述中。尽可能多的成分在薄层检识中需要被鉴别。完善的薄层图谱应该能最大程度的把中药中的主要成分直观表现出来,更好的发挥其定性鉴别作用。2.2.2特征图谱特征图谱是指对于一个中药品种或其提取物,共用的具有特征性的一类或几类成分的色谱或光谱图,在标准的构建中可以用于定性鉴别。2010年版《中国药典》中新增加了特征图谱项,如人参茎叶总皂苷、人参总皂苷、山楂叶提取物、连翘提取物、肿节风浸膏、茵陈提取物、满山红油等提取物都有其特异性的鉴别图谱,这是《中国药典》在标准工作中的又一进步。特征图谱不要求与指纹图谱一样对图谱的相似性进行全面评价,它的主要特点是要突出该品种与其他品种不同的特异性成分,并将这些成分作为特征峰通过与S峰(参照物峰)的相对保留时间的计算,进行色谱峰在特征图谱上的定位,这些峰可以是已知的,也可以是未知的。如满山红油的特征图谱中峰1是已知的乙酸龙脑酯,峰8是S峰-牻牛儿酮,其他特征峰根据相对保留时间定位判断,并不需要进行成分的指认。在美国药典与欧洲药典中,也有类似特征图谱样的谱图鉴别出现在鉴别(identification)项下。主要采用对照提取物为标准溶液,对样品进行鉴别,用于鉴别特征色谱峰并可配合定量分析方法进行各个色谱峰的定位。总结国内外的研究方法,基本思路是一样的,都是首先采用对照药材或对照提取物建立对照特征图谱,并对特征成分进行说明,应检出的特征峰数,包含成分不明确的色谱峰,尽量使评判标准简单明确。在标准中要求检测出与对照药材或对照提取物一样的色谱峰,用来说明中药中所含成分。并提示最好采用对照药材或对照提取物进行系统适用性实验,调整分析参数,从而保证定性研究与定量研究的一致性。2.2.3指纹图谱中药指纹图谱系指中药经适当处理后,采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体或部分化学特性的色谱或光谱谱图。中药指纹图谱应最大限度地表征药效相关成分或特征成分,满足整体性、专属性和重现性的要求。经过多年的探索与应用,指纹图谱终于走进了2010年版《中国药典》,在中药的质量控制与评价中发挥着巨大的作用。三七总皂苷、三七三醇皂苷、丹参总酚酸提取物及丹参酮提取物等研究比较深入全面的提取物都建立了成熟的指纹图谱方法。目前,指纹图谱已经广泛应用到药材的真伪优劣鉴别以及新药生产过程的质控中。如市场上许多伪药都是通过单一成分加入来达到现有的质量标准。当采用指纹图谱后,对于多成分的全面的控制使伪劣产品的鉴别找到了切实可行的办法。指纹图谱方法目前在美国药典与欧洲药典中还没有采用,但在中药标准国际化的过程中,指纹图谱的方法也一定会被收载草药和植物药的各国药典所接受和学习。2.3测多评方法的核心要义在于检测峰的确定,同时把相对转换因子作为由于已经认识到中药化学成分的多样性,作用基础的多靶点,并且是多成分协同起效,国家药典委员会从2005年版《中国药典》的修订时就提出加强中药质量标准的整体研究,需要对尽可能多的活性成分进行定性定量研究。据笔者实验室统计,在2010年版《中国药典》中,中药材的多指标成分(≥2)含量测定共有90个品种,占总药材的15.18%;植物油和提取物多指标成分含量测定为17个,占提取物总数的36.17%。但是大多数还局限在对2种指标成分的含量测定,其中对3个以上指标成分测定的品种共有26个,其中最多测定5个指标成分,仅有2个中药。多指标成分的质控是大势所趋,但是对照品的提供是该方法应用的瓶颈。由此,能够进行多指标含量测定的一测多评方法受到越来越多的重视。一测多评方法是指在含量测定时,采用一个对照品,同时对多个成分进行含量测定。其他成分通过相对保留时间及对照药材(或对照提取物)的特征图谱确认色谱峰,进而根据相对转换因子计算其他色谱峰的含量。与传统的多指标成分定量评价方法相比较,主要是在标准执行阶段,后者需要更多的对照品,而一测多评法在方法构建阶段时,要比后者多进行相对转换因子和相对保留时间的计算,对方法的耐用性要求更高。一测多评方法构建的内容包括:指标成分的确立、分析方法的建立、相对校正因子及相对保留时间的计算、方法学验证及多个实验室复核等,其中相对校正因子是一测多评方法的核心,如何保证方法建立过程中所获得的校正因子具有可重复性是该分析方法的关键所在。笔者实验室在研究工作中重点对校正因子的多方面影响因素进行了考察［18-19］,由于校正因子的存在,所以在标准中对于实验条件与参数要尽可能详细地描述。据统计,美国药典37版中,共有包括植物、