牛体外受精技术的研究进展

牛体外受精技术的研究进展

动物繁殖技术是生物技术的一个重要分支。繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到20世纪70年代胚胎移植技术的应用，似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。牛的繁殖技术在过去的50年里取得了显著进展，这是一个以人工授精起始的连续过程。随着体外受精、精子分离和核移植（克隆）等技术的发展，这些连续性的繁殖技术将是目前和未来提高生产力的强有力手段。1其他方面的研究自1982年以来，家畜体外受精技术，尤其是牛体外受精(IVF)技术的发展十分迅速，仅仅10年时间，就已从理论上、方法上得到充分的完善和发展，成为动物胚胎工程及细胞工程领域内的一个基本和重要的研究分支，并从20世纪80年代末就开始进入应用阶段。牛IVF技术的主要环节包括：(1)屠宰牛卵巢卵母细胞的采集、保存和运输。(2)卵巢卵母细胞的采集：利用注射器吸取或其他方法，将未成熟的卵母细胞从可见卵泡中取出，然后在显微镜下选择卵丘细胞层完整的正常卵母细胞进行体外成熟培养。(3)卵母细胞的体外成熟培养(IVM)：将处于生发泡期的未成熟卵在添加激素或血清的培养基内培养至成熟阶段，进行体外受精。(4)精子的体外获能处理：体外条件下利用化学药物(IA、咖啡因及肝素等)使精子达到获能状态。(5)受精处理：把培养成熟的卵子和获能处理好的精子放在一起培养，使其在体外条件下完成受精过程。(6)受精卵的体外发育培养(IVC)：通过一系列培养条件的探索，使受精卵发育到桑椹胚和囊胚阶段。(7)发育胚胎的冷冻保存。(8)胚胎的质量评定。(9)胚胎移植：这是体外受精技术的最终目的。(10)受体牛的妊娠诊断和管理。由于牛IVF技术在养牛业上的巨大应用潜力，世界上许多发达国家均投入大量的人力和财力进行了牛IVF胚的开发性研究，从而促使牛IVF技术从实验研究开始走向商品化应用。目前世界上在这项技术上投入力量最大的有日本、美国、英国，中国和丹麦也做了大量工作。在20世纪90年代中叶，美国、加拿大和欧洲（主要是德国、意大利、法国和荷兰）就出现了IVF商业化应用的实验室。几年后，在南美洲（如巴西和阿根廷）和大洋州（如澳大利亚和新西兰）也建立了这样的实验室。采用超声波扫描经阴道活体采集卵母细胞技术（OPU）的应用加速了IVF在活体家畜上的应用。目前，对供体牛采卵有2种方法：其一是对供体牛不做任何处理，每周采卵1次；其二是对供体牛进行激素处理，使之有更多的中、小卵泡出现后再进行采卵。经激素处理供体牛的效果明显优于不处理。IVF商业化应用的最初目的是从母畜体内获得成活的胚胎而不使用传统技术来受孕。目前，IVF是胚胎移植（ET）程序的一部分。它主要应用于那些发情处理较为困难、不能生产可移植胚胎的母畜或者是在繁殖期间出现异常的母畜（如卵巢粘连或输卵管阻塞）。IVF也应用于由于年龄、突发状况、疾病等造成的繁殖障碍的母畜，以及在妊娠期前3个月内的怀孕小母牛或成年母牛。IVF还应用于正常繁殖周期的小母牛和成年母牛以及发情期前的犊牛。商业性机构和研究机构已将OPU-IVF技术应用于不同类型的母畜（包括初情期前的犊牛、小母牛、成年母牛），不同年龄的母畜（包括初情期前、初情期后和适龄母牛），不同品种，不同繁殖周期（间期、妊娠期和分娩后），不同采卵频率（1周1次、1周2次、1个月2次），不同激素处理（FSH,nBST）和不同的IVF过程（BRL细胞共培养，化学限定培养液，血清），并获得不同程度的成功。IVF技术可提高精子使用效率。在精子细胞内注射（ICSI）技术未广泛应用于牛IVF商业化生产之前，IVF技术就为使用相对少量精子生产成活胚胎提供了条件。这使精子利用率更高，并为精子性别分离提供重要条件。从1992年到2000年，使用的胚胎培养液从TCM-199培养液到与BRL细胞共培养的MenezoB2培养液，其中加入10%胎牛血清（FCS）来培养胚胎。从2001年开始，培养系统改为SOF的柠檬酸盐半限制性培养液（添加5%FCS）从而避免或减少出现犊牛体型过大综合征的危险。在SOF系统中培养的第6.5d才观察培养皿内胚胎的发育状况，培养箱内的条件是5%的O2、6%的CO2、和89%的N2，并保持较高湿度。由于胚胎体外冷冻的不良效果，通常采用鲜胚进行移植。可能是由于培养条件或受精程序造成胚胎对外界条件较为敏感。IVF技术的应用效果受很多因素的影响，其中主要因素是供体的状态，卵母细胞的质量和将胚胎从合子培养到囊胚期的技术。尽管IVF技术从应用到动物育种上开始至今，这项技术已有较大发展，但仍有许多改进之处，包括提高卵母细胞和胚胎的活性，减少培养系统对犊牛出生大小的影响，提高卵母细胞的质量，成功使用性别分离后的精子，ICSI技术以及腔前卵泡的培养，这些方面将是最近及未来研究的主要方向。2体外法性别鉴定与性别分离肉牛生产者和牛产业中一直都对性别预测给予广泛关注。精子性别分离处理后可以通过生产期望性别的个体从而增加奶牛和肉牛业的效益，并能充分满足市场和商业化生产的需要。最典型的例子是生产奶牛的母犊以及肉牛生产中所需的公犊。对于牛育种者和精子人工授精公司，可应用这项技术在小范围母牛群内选育出优秀公牛。精子性别鉴定常采用DNA含量的方法；胚胎性别鉴定方法包括活体检查与PCR、免疫荧光法等；对胎儿性别鉴定常采用妊娠60～90d超声波检查的方法。应用这项技术时大多得到满意的结果，准确性较高。并且可根据既定目标提前对性别进行分离（精子性别或胚胎性别），而不必等到胎儿时期进行性别分离。在美国，胚胎性别鉴定大规模商业性过程中使用的唯一方法是活体检查胚胎后用PCR扩增Y染色体上特定DNA，这种方法对90%以上的胚胎有效，准确率达95%。尽管如此，应用PCR对胚胎进行性别鉴定时，所有的胚胎必须活体检查后测定，并且大约50%的非期望性别的胚胎被废弃，其效率也不高。胎儿的性别鉴定通常在妊娠期55～90d进行，为了改变性别比例必须终止不需要的妊娠，这种改变性别比例的方法也较烦琐和昂贵。最初的商业化胚胎性别鉴定程序是美国TransOraGenetics公司的AB技术法，这个程序需要5min进行活体检查，PCR过程需2h，一些胚胎需使用Y-扩增产物。目前，一家公司（XY,Inc,FortCollins,Colorado,America）已拥有成功分离X、Y精子的技术，其原理是根据X和Y精子中DNA含量的不同。在牛和马上，X精子中的DNA含量比Y精子多4%。采用高速流式细胞分离仪可在几分钟内分离6百万个X或Y精子，纯度达90%。精子性别分离后可应用于AI、ET和IVF程序。目前报道的结果表明小母牛采用冷冻的性别分离后的精子进行AI后，在子宫体内沉积的精子低剂量（1～1.5×106个精子）和高剂量（3×106个精子）两组的妊娠率（大约50%）相似。阿根廷科学家也得到相似的结果。采用冷冻的性别分离的精子IVF后，胚胎发育率达18%～26%。但由于超排处理的供体肉牛和奶牛很难将AI的精子运送到输卵管受精部位，这阻碍了冷冻的性别分离精子在胚胎移植商业化中的广泛应用。美国TransOraGenetics公司目前获得的卵巢来自荷斯坦牛，卵母细胞回收后用X精子进行授精，得到的胚胎移植到奶牛体内。最终可获得较高的妊娠率，稳定的育种性能。在结合体外受精技术的同时，性别控制技术将在养牛业中产生不可估量的影响。3克隆技术在克氏原螯虾群体复制中的应用前景展望克隆是用来描述体细胞核移植过程的简称，是目前应用的一项辅助繁殖技术。Spreeman(1938）定义胚胎细胞核移植技术是指将一个多细胞胚胎的卵裂球或细胞核通过显微手术和细胞融合的方法，移植到1个去核的卵母细胞或去核的受精卵中，构成新胚胎（克隆胚胎），然后移植给受体，获得与核供体胚胎基因型相同的后代（克隆动物）的生物技术。Wilut等（1997）获得了成年绵羊乳腺上皮细胞核的克隆后代，这一突破性成果为成年哺乳动物的完整复制打下了基础。经济效益和遗传改良并不是克隆的唯一目的。牛的克隆可以用来展览，保种等，目前，对特定基因型的克隆引起很多实验室的关注。未来，克隆技术将在肉牛和奶牛商业化生产中起关键作用，克隆可加速由核移植带来的遗传改良的普及。胚胎克隆将对奶牛生产产生较大冲击。我们使用优秀胚胎作为核源进行移植，而不必对母牛进行人工授精。作为克隆的核源，其遗传性状要好于商业化种群的平均性状，克隆加速了非杂交遗传效益的广泛开发。在商业化农场中使用克隆技术生产克隆动物减少了后备牛群中母牛的百分比。尽管核移植的平均效率已经有很大提高，但其变异仍较大。影响核移植效率的变异来源不仅包括基因型，还包括核源的核型，核移植前供体细胞的处理，以及受体卵母细胞的来源。真皮中成纤维细胞是最常用的供体细胞。这些细胞可以从任何性别中获得并可在标准组织培养液中培养。目前，牛克隆的商业化应用取决于社会和制度的接