中国黄酒麦曲香气成分的定性与分析

中国黄酒麦曲香气成分的定性与分析

小麦法和小麦法是中国黄酒的制备工艺的特点。人们普遍认为，被称为“酒之骨”的麦曲是黄酒酿造的动力，具有“糖化、发酵、生香”功能，对黄酒酿造起着举足轻重的作用。但是，对于麦曲的理解和研究还停留在简单的生物学作用上，仅仅以糖化力、液化力和发酵力作为评价麦曲质量优劣的指标。随着黄酒酿造科学的发展，黄酒的生产科研人员虽然已经认识到黄酒麦曲对黄酒风味的重要性，但是受到研究理念和技术的限制，对于非常重要的麦曲“生香功能”涉及极少，只停留在推测和分析上。在过去对黄酒麦曲的研究中，并没有系统地研究麦曲风味特征，更没有用现代风味化学手段对麦曲风味物质进行科学的研究。麦曲赋予黄酒的“生香功能”，不仅在于能给黄酒提供生成香味成分的酶及风味前驱物质，更重要的是本身也含有丰富的香气物质，是黄酒风味的直接给予者。因此，要了解黄酒麦曲对黄酒风味的作用，首先得用现代风味化学手段，来了解黄酒麦曲中主要香气化合物的种类和含量及有重要贡献的香气化合物。日本清酒米曲对清酒的作用和中国黄酒麦曲对黄酒的作用非常相似。高桥美绘等用顶空吸附萃取技术对日本清酒米曲中的香气物质进行了研究。共鉴定出11种香气化合物，并且发现1-辛烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基-2-庚烯-6-酮、苯乙醛、1-辛烯-3-醇是米曲的重要香气物质。虽然日本清酒米曲中香气物质的研究对我国黄酒麦曲香气研究有重要的参考意义，但是日本清酒米曲是由纯种培养的米曲霉发酵制成，曲菌较单一，其代谢产物也较为简单，鉴定出的风味物质也很少，因而对黄酒的借鉴作用有限。黄酒麦曲微生物菌群复杂，随之产生的风味物质也很丰富，分析其中的香气物质存在一定的困难，有必要寻找更好的方法来研究其中的香气物质。黄酒麦曲中究竟含有何种香气物质、含量多少、有多大贡献、用何种技术、方法和手段来分析，目前还是个盲点。黄酒麦曲挥发性香气成分含量甚微，要检测其中的挥发性香气化合物，首先得对样品进行浓缩预处理。常见的浓缩预处理方有液-液萃取法、蒸馏法、固相萃取法、固相微萃取(SPME)法等。其中SPME法具有操作简单、快速、灵敏度高、选择性好、样品量少、无需溶剂的优点。近些年来，SPME法在食品行业有着广泛的应用，如在食醋、苹果酒、白酒中香气物质分析方面的成功应用。随着食品风味分析的发展，SPME法在中国黄酒风味物质方面的分析，也得到了令人满意的结果，如陆燕等用顶空固相微萃取法(HS-SPME)对用传统法和糯米膨化法酿造的黄酒风味物质进行的分析检测，罗涛等用顶空固相微萃取法对黄酒中的挥发性和半挥发性微量成分进行了分析研究，鉴定出的挥发性和半挥发性微量成分有97种。故研究选择顶空固相微萃取法来分析黄酒麦曲中香气物质。对黄酒麦曲中的香气物质进行定性分析，首先必须准确鉴定出黄酒中的香气物质的种类。目前国内对食品中香气物质的定性一般直接采用气质联用法(GC-MS)分析。而GC-MS只能初步尝试性地鉴定其中的微量成分，并不能有效地、准确地鉴定出样品中香气活性物质。气相色谱-嗅闻法(GC-O)是解决这一问题的理想方法，该技术是目前国际上最为先进的、可以将气味检测仪与气相色谱仪结合的一种风味化合物分析技术。不仅如此，采用气相色谱-嗅闻法中的香气强度法（GC-Osme）还能帮助初步推断样品中有重要贡献的香气化合物。近年来，气相色谱-嗅闻法在国外的应用已得到了蓬勃发展，如在葡萄酒、干酪等食品风味分析方面的应用。因而研究采用GC-Osme法，结合气质联用(GC-MS)法来定性分析黄酒麦曲中的香气物质。要准确得知黄酒麦曲中香气物质的含量需要对其进行定量分析。而定量分析得出的香气物质浓度只能给出其在黄酒麦曲中的具体含量，并不能准确反映其在黄酒麦曲中的香气贡献及贡献程度，香气活力值（OAV）可以达到这种目的。香气活力值是指香气化合物的浓度和香气阈值之比，香气阈值是指嗅觉器官所感觉到的香气化合物气味时的最低浓度。只有那些含量超过其香气阈值的化合物才有香气贡献，并且香气活力值大的香气化合物其香气贡献亦大。因而本研究采用香气活力值法来准确分析黄酒麦曲中有重要贡献的香气物质。本研究采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)、气质联用(GC-MS)法、GC-O香气强度法及香气活力值（OAV）法对中国黄酒麦曲中的香气成分进行定性定量分析，对黄酒麦曲中主要香气化合物的种类和含量及有重要贡献的香气化合物进行较全面的研究。以拓展到对黄酒麦曲中香气物质的形成机理、黄酒麦曲曲香与黄酒风格相关组分关系的研究，以丰富黄酒的酿造科学与理论，以期应用于黄酒业黄酒风味的调控和黄酒质量的提高。1材料和方法1.1标样、无水乙醇黄酒麦曲：均由江、浙、沪、鲁黄酒厂提供。氯化钠和氯化钙均为分析纯：购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；其余标样、无水乙醇均为色谱纯。2-辛醇(96%)和2-苯乙醇(99%)：购自Fluka公司(SigmaAldrich,China)；辛酸(98%)；购自吴江慈云香料香精有限公司；己醛(98%)：购自北京北大正元科技有限公司；其他(纯度均>98%)均购自Sigma-Aldrich(中国)公司。1.2方法1.2.1标准溶液的配制准确称取一定量标准品配制到无水乙醇中，再稀释制成一系列浓度的标准溶液。内标混合溶液：2-辛醇和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的无水乙醇溶液。1.2.2化合物的测定采用HS-SPME和GC-MS分析麦曲中的挥发性香气化合物，按参考文献的方法。GC-MS分析：安捷伦公司6890NGC和5975MS。进样口和检测器温度均为250℃，He为载气，流速为2mL/min。毛细管色谱柱为FFAP(60m×0.25mm×0.25μm)。程序升温：50℃恒温2min，以6℃/min的速度升温至230℃，保持15min。EI电离源，温度为230℃，电子能量70eV。物质的定性分析：是将未知物的图谱与NIST05a.LDatabase(AgilentTechnologiesInc.)中标准谱图进行比对，结合物质香气，并与标准物的保留时间、香气进行对比验证，确定所检出的化合物。物质的定量分析：采用国际上流行的内标标准加入法，即每个香气化合物分别对应于内标做标准曲线。经过GC–MS检测后利用待测物质和内标的相对峰面积比代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质在麦曲中的含量。香气活力值(OAV)：香气活力值是香气化合物的浓度与该香气化合物的香气阈值浓度（在水中的浓度）之比。2结果和分析2.1挥发性香气化合物黄酒麦曲成分复杂，用HS-SPME和GC-MS能够检测到很多种挥发性微量成分经，附图为HS-SPME检测的所得GC-MS总离子流谱图。但是，不是所有的挥发性物质都能呈现香气，因此结合GC-O香气强度法分析，确定了黄酒麦曲中有香气特征的挥发性香气化合物。黄酒麦曲中挥发性香气化合物的定性检测结果见附表。共鉴定出了42种挥发性香气化合物，其包括2种醛类化合物、3种酮类化合物、11种醇类化合物、3种酯类化合物、5种酸类化合物、5种芳香族化合物、1种呋喃类化合物、1种含硫化合物、1种内酯类化合物、5种酚类化合物、5种含氮化合物。其中，香气最强的物质有1-辛烯-3-酮（蘑菇香）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香）、4-乙烯基愈创木酚（辛辣味，丁香）等。香气强的物质有己醛（青草香，苹果香）、己酸乙酯（水果香，花香，甜香）、辛酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香，蜂蜜香）、愈创木酚（辛辣气味，丁香，烟熏气味）、香兰素（香草香）等。可以初步推断这些化合物对黄酒麦曲的生香功能起着重要的作用。黄酒麦曲中有着如此多的香气成分，也证明了其生香功能对黄酒风味贡献的重要性。2.2分离出合理的香气化合物对已定性的42种挥发性香气化合物进行了定量分析。根据标准曲线计算得到了在黄酒麦曲中的准确含量。附表也列出了黄酒麦曲中挥发性香气化合物含量情况。在所定量的化合物中，含量居前三位的化合物依次是乙酸乙酯（11831.39μg/kg）、异戊醇（3158.62μg/kg）、苯乙醇（2410.32μg/kg）。预计这3种化合物对构成黄酒麦曲整体香气的基本骨架有比较重要的影响。从附表可以看出，酯类、醇类、酸类、酚类及其衍生物含量较丰富，推测对黄酒麦曲的整体风味有较大影响。但化合物含量高并不意味着对黄酒麦曲的贡献就大，需要结合对应的阈值才能间接判定其在黄酒麦曲中的重要性。查阅相关文献，得到42种挥发性香气化合物在水中的香气阈值，根据浓度和香气阈值之比，计算出了香气化合物在黄酒麦曲中的OAV值。结果表明（见附表）：麦曲的挥发性香气化合物中有18种化合物的浓度高于其香气阈值，说明这18种化合物对黄酒麦曲都有一定的香气贡献。其中OAV值在1～5的香气化合物有2-庚酮、2-辛酮、3-辛醇、乙酸乙酯、苯乙醇、4-甲基苯酚。这些化合物对黄酒麦曲的曲香都有不同程度的贡献。OAV值在5～10的香气化合物有异戊醇、庚醇、苯并噻唑、γ-壬内酯。这些化合物对黄酒麦曲的曲香都有较大的贡献。OAV值大于10的香气化合物有1-辛烯-3-酮（OAV=618.11）、4-乙烯基愈创木酚（OAV=386.01）、1-辛烯-3-醇（OAV=291.45）、己酸乙酯（OAV=142.13）、己醛（OAV=109.18）、辛酸乙酯（OAV=51.36）、愈创木酚（OAV=21.29）、苯乙醛（OAV=13.36）。故可以推断，这些化合物对黄酒麦曲有重要贡献，是黄酒麦曲中最重要的特征香气化合物。通常，香气强度大的物质同时亦具有较大的OAV值。如1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈创木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈创木酚等香气强度大的物质，其OAV值也大。但实际结果表明，也有例外，一些香气强度大的物质，却含量甚微，甚至未被定量测出，如香兰素。分析原因是由于香兰素的香气阈值极低，因此香气强，但其浓度却极低，低于标准曲线下限，因而未被定量出。根据香气强度和OAV值结果可以断定：1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈创木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈创木酚等这些化合物是黄酒麦曲中重要的香气化合物，对黄酒麦曲香气贡献非常大。1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇在黄酒麦曲中香气强度大、OAV值高，是黄酒麦曲中最重要的香气物质，它们在日本米曲中也很重要。其中1-辛烯-3-醇来源于微生物产生的磷脂β-氧化反应，其前驱物质是亚油酸，而1-辛烯-3-酮则是由1-辛烯-3-醇通过酶的氧化作用而形成的。日本清酒米曲的香气物质研究中，发现在米曲的制作过程中，随着发酵的进行，微生物菌体不断繁殖生长，亚油酸的浓度也不断增加，1-辛烯-3-醇含量也增加，他们推断在制曲过程中，亚油酸可作为菌体生长的一个指标。为此我们也可以在黄酒麦曲的制曲过程中，根据香气物质1-辛烯-3-醇的含量来判断黄酒麦曲的发酵情况，因此香气物质的含量可以作为判断麦曲发酵好坏的重要信息源。另外，己醛也是黄酒麦曲中重要的香气物质，赋予麦曲以优雅的青草香气，己醛也来源于磷脂β-氧化反应，前驱物质是亚油酸。4-乙烯基愈创木酚和愈创木酚是黄酒麦曲中另一类重要香气物质，赋予麦曲辛辣味、烟熏气味、丁香、中药气味。4-乙烯基愈创木酚在黄酒麦曲中香气强度大，OAV值也高，主要来源于微生物发酵中阿魏酸的脱羧反应，此反应的微生物主要有霉菌（如白腐菌，黑曲霉和青霉菌等）、酵母（如酿酒酵母、汉逊氏酵母、假氏酵母等）、某些细菌（如枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、植物乳杆菌、和荧光假单胞杆菌等）和放线菌如链霉菌等。阿魏酸在粮谷类含量丰富，在小麦中含量为0.05g/kg～0.5g/kg。以阿魏酸为前驱物质，由微生物代谢，可以产生一系列的挥发性酚类化合物，除产生4-乙烯基愈创木酚外，还产生愈创木酚、香兰素、4-乙基愈创木酚等。香兰素呈现令人愉快的香草香，其含量甚微，但阈值低，故在GC-O闻香中检测其香气强。己酸乙酯和辛酸乙酯表现为水果香、甜香和花香，它们也是黄酒麦曲中重要的香气化合物，给麦曲以令人愉快的香气。酯类物质来源于醇和酸的酯化反应，也可以来源于微生物的醇酰基转移酶和醇的缩合反应。因此它们的形成和微生物发酵过程中产生的乙酰辅酶A有关。苯乙醛是清酒米曲中重要的香气化合物，在中国黄酒麦曲中也非常重要。苯乙醛赋予黄酒麦曲令人愉悦的、柔和的玫瑰花香、蜂蜜香，主要来源于微生物氨基酸代谢，其前驱物质是苯丙氨酸。3酒精麦曲中主成分的检测研究运用顶空固相微萃取法(HS–SPME)、气质联用法(GC-MS)、GC-O香气强度法及香气活力值（OAV）法的新技术和手段，全面剖析了黄酒麦曲中的香气物质，为黄酒麦曲的风味分析提供了思路和技术。研究采