自溶法制备甘露聚糖的工艺研究

自溶法制备甘露聚糖的工艺研究

祖母甘露醇糖位于母系膜的最外层。它与位于中间和外层的葡萄糖一起组成祖母膜的主要糖组成。由于其抗炎性、柔软性、抗病性、革兰氏菌病毒检测等功能，已成为具有较高市场潜力的绿色饲料添加剂和食品添加剂。制备酵母多糖的一般方法有酸法和碱法，然而这些方法对环境污染较大，制约了酵母多糖的工业化生产。酵母自溶是在自身水解酶类作用下的细胞自身解体过程，其主要作用酶类为蛋白酶，自溶时生物膜首先被破坏，然后产生细胞内部结构的水解，由于内源葡聚糖酶、甘露聚糖酶作用的最适温度较低，在一般自溶条件(50～60℃)下活性很低，细胞壁成分分解较差，因此，自溶最后常剩下细胞外壳。由于整个自溶过程条件温和、无环境污染，因此酵母自溶法有望成为制备酵母多糖的一种有效方法。本实验拟研究自溶法制备啤酒废酵母甘露聚糖的工艺条件，并将优化后的自溶法和常用的酸碱法进行比较，最后对最优自溶条件在5L发酵罐中进行放大实验。1材料和方法1.1材料和方法啤酒废酵母青岛啤酒股份有限公司。甘露单糖、葡萄糖为分析纯，木瓜蛋白酶(20～300万U/g)。1.2蒸发光散射器nmfUNICOUV-2000分光光度计;岛津液相色谱系统(CBM-20A、LC-20AD、SIL-29A、CTO-20AC、Sedex75蒸发光散射器检测仪);Hanbon氨基柱;KJELTECTM2300FOSS全自动定氮仪;恒温水浴锅;离心机;具塞离心管;磁力搅拌器;FMG-5L发酵罐上海国强生化工程装备有限公司。1.3方法1.3.1总甘草糖、总氮和总水杨酸的测定总甘露聚糖的测定参照文献进行；上清液中甘露单糖、葡萄糖的测定参照HPLC法；总氮测定采用凯氏定氮法；总核苷酸测定采用紫外吸收法。1.3.2酵母泥的制备取新鲜啤酒废酵母，用0～4℃蒸馏水洗涤并离心(6000r/min,10min)，重复2次至上清液无色，得到预处理的酵母泥。取处理后的酵母泥6×4.0g悬浮于6×4.0ml0.1mol/LpH7.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液中自溶，自溶在具塞离心管中进行，自溶温度为50℃，恒温水浴保温，自溶时间24h，每隔4h取一次样，离心(6000r/min,10min)，取沉淀测定总甘露聚糖含量。1.3.3微胶囊的聚糖合成根据1.3.2确定的自溶时间，设计L9(33)正交试验，进行不同自溶条件实验，确定自溶优化条件。酸法、碱法制备甘露聚糖参照文献、进行。酸法：配制1.0mol/L醋酸溶液100ml，加入预处理的酵母泥5g，在90℃下反应3h,6000r/min离心10min，沉淀物水洗2次后用于测定甘露聚糖含量；碱法：配制1.0mol/L氢氧化钠溶液100ml，加入预处理的酵母泥5g，在90℃下反应3h,6000r/min离心10min，沉淀物水洗2次后用于测定甘露聚糖含量。1.3.4此外，酶对自溶效果的影响以1.3.3确定的自溶条件进行不同添加时间、不同浓度蛋白酶自溶条件实验，确定外加蛋白酶对自溶效果的影响。1.3.5实验的扩展以1.3.3确定的自溶条件取预处理后的1500g新鲜啤酒废酵母在5L发酵罐中进行放大实验，搅拌转速为100r/min。2结果与分析2.1发酵时间对水解酶活性的影响由图1可知，在自溶的16h内，酵母残渣中甘露聚糖含量增加比较缓慢，这是因为酵母细胞死亡需要一定的时间，只有当细胞死亡后，胞内的各类水解酶才能被活化发挥作用，从而使酵母细胞中的蛋白质和核酸从细胞内溶出至上清液中。开始保温自溶16h后胞内酶开始发挥显著作用，20～24h后甘露聚糖的浓度变化趋于稳定。所以选择24h作为自溶时间。2.2自溶法和常用的酸法、碱法制备露天气溶剂提取效果比较一般来说，影响蛋白酶活力的主要因素有温度、pH值、NaCl浓度，选取温度、pH值和NaCl浓度三个因素的三个不同水平，利用L9(33)正交试验表(表1)，测定不同自溶条件下酵母残渣中的甘露聚糖含量，以确定最优的自溶条件，正交试验结果见表2。以酵母残渣中的甘露聚糖含量为判断自溶效果的指标，根据表2，酵母自溶的最优条件组合为A2B2C2，即50℃、pH6、2%NaCl(W/V)，在此条件下，酵母残渣中甘露聚糖含量为164.95mg/g。从表2极差的大小可以看出，因素的重要性次序为：温度>NaCl浓度>pH值。进一步比较优化条件后的自溶方法和常用的酸法、碱法制备甘露聚糖，实验结果如表3所示。从表3可以看出，自溶法制备的酵母残渣中甘露聚糖含量约为酸法、碱法的2倍，对于作为杂质的蛋白质，自溶法含量为酸法、碱法的1/2，三种方法中核酸杂质含量接近，约为750μg/g。酸法、碱法的酵母残渣中甘露聚糖含量较低，可能是因为酸法、碱法反应条件较自溶法剧烈，致使部分甘露聚糖转移到上清液中，同时酵母细胞壁是由一个三层壁障致密结构，其外层为甘露聚糖形成的糖蛋白、中层为碱溶性β-葡聚糖，内层为坚硬的碱不溶性β-葡聚搪，即使剧烈的酸法、碱法反应条件也不足够完全破坏酵母细胞壁，使胞内的蛋白质、核酸渗漏出胞外，而自溶法却能利用自身的蛋白酶降解膜蛋白增加细胞壁通透性，并使胞内蛋白质在蛋白酶、核酸在核酸酶作用下降解为小分子肽、核苷酸，使蛋白质、核酸更容易渗透到胞外。2.3可溶性甘薯淀粉中露天酸对甘薯聚糖含量的影响为了进一步提高酵母自溶残渣中的甘露聚糖含量，实验研究了外加蛋白酶对酵母自溶的影响。在2.2确定的最优自溶条件下的自溶混合物中分别加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的木瓜蛋白酶(20～300万U/g)，50℃自溶24h，并以加蛋白酶1%后自溶作为对照，离心取残渣沉淀测定其中甘露聚糖的含量，结果如图2所示。从图2可以看出，外加蛋白酶对提高酵母残渣中甘露聚糖含量有一定作用，在0.4%的加入量以内，酵母残渣中甘露聚糖含量增加比较显著，0.4%～1.2%的蛋白酶加量范围内，酵母残渣中甘露聚糖含量变化趋于稳定，所以，如果添加蛋白酶，可以选择0.4%作为最适加酶量，但考虑到即使在0.4%蛋白酶加入量时，酵母残渣中甘露聚糖含量仅增加13.85%，且蛋白酶成本较高，所以，不适合通过外加蛋白酶的方式提高酵母残渣中甘露聚糖含量，因此，本实验选择不加蛋白酶的方式进行酵母自溶放大实验。2.4自溶法制备培育甜聚糖以2.2确定的最佳自溶条件在5L发酵罐中进行放大实验，结果如表4所示。根据表4，放大实验酵母残渣中的甘露聚糖含量为149.00mg/g，与2.2小试中164.95mg/g接近，因此酵母自溶最优条件得到较为成功的375倍放大。对表4的结果进一步分析发现，在此条件下，沉淀、上清液中甘露聚糖分别占原料中甘露聚糖的92.05%、0.72%，即酵母自溶法中甘露聚糖的得率为92.05%，沉淀、上清液中甘露聚糖量之和小于原料中的甘露聚糖总量，是因为在发酵罐自溶操作中有一定的物料损失。进一步对上清液进行HPLC分析得到图3的HPLC图谱。以增高法分析发现，1号峰为甘露单糖，含量为55.72μg/ml,2～7号峰均不是葡萄糖，对比表4中上清液甘露聚糖含量发现，上清液中总的甘露聚糖含量远大于甘露单糖含量，据此可以初步认为，转移至上清液中的甘露聚糖主要是含两个单糖分子以上的寡糖，而不是甘露单糖。3最佳自溶条件的确定本实验研究了自溶法制备啤酒甘露聚糖的工艺条件，并将优化后的自溶法和常用的酸碱法进行了比较，最后对最优自溶条件在5L发酵罐中进行了放大实验。结果表明，自溶24h后，酵母残渣中的甘露聚糖含量达到最高值；制备啤酒废酵母细胞壁的最佳自溶条件为：温度50℃，NaCl2%，pH6，在此条件下，酵母自溶残渣中甘露聚糖含量达到164.95mg/g，而传统的酸法、碱法所得酵母残渣中甘露聚糖的含量为83.35、87.60mg/g，自溶因素的重要性次序为：温度>NaCl浓度>pH值；外加蛋白酶有利于提高自溶残渣中甘露聚糖的含量，外加0