浓盐法提取啤酒酵母中rna的研究

浓盐法提取啤酒酵母中rna的研究

在含有大量负反应的样品中，含有乌尔姆和乌尔姆的药物。其中，鸟苷酸（pm）和肌肉苷酸（imp）是强新鲜药物，细胞苷酸（cmp）和尿苷酸（ump）可用作生产手段，如癌症、肝炎和冠状动脉粥样硬化。在化妆品中加入核酸或其水解物,可促进皮肤蛋白合成,达到养护皮肤的作用。在农业上,RNA降解物具有促进作物生长增产的作用,已在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜生产中应用,取得了明显的增产效果。19世纪末,Hammars从酵母细胞中提取不含蛋白质的RNA。作为啤酒工业的副产物之一,啤酒废酵母中RNA含量达6%～8%,是RNA生产的较好原料,充分利用它,既减少环境污染,又创造了可观的经济效益。从啤酒酵母中提取RNA的工艺方法很多,广泛应用于工业化生产的有浓盐法和稀碱法。由于稀碱法提取颜色较深,很难溶解,而且对设备要求较高,设备一次性投资费用较大,再加上管理和维护等原因,一般采用浓盐法。该方法简单可靠,对设备要求较低,便于管理和维护。浓盐法提取啤酒废酵母中RNA,是基于改变啤酒废酵母的渗透压,使酵母细胞自身破裂,释放出RNA。本文主要就浓盐法提取啤酒酵母中RNA进行研究。1材料和方法1.1原材料啤酒酵母,由辽宁天湖啤酒厂提供。供试菌种处于对数期,此时含RNA最丰富,约为6%～8%。1.2主试剂酒石酸、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、乙醇、氨水(均为国产分析纯)。1.3主要实验设备HH-6型数显恒温水浴锅、101-1型电热鼓风干燥箱、FA-2004电子分析天平、JW-2万能粉碎机、0.147mm不锈钢筛。1.4方法1.4.1酵母泥的预处理啤酒经发酵后回收的酵母,含有麦芽壳、酒花沉淀与析出蛋白质沉淀等物质,同时在酿造过程中,由于一些酒花及代谢产物吸附在酵母上,酵母呈淡咖啡色,带有苦味与令人不愉快的酵母味,对成品有不良影响。因此,在提取之前,酵母泥必须经过洗涤,进行除杂脱苦等处理。预处理工艺过程如下:啤酒酵母→水洗2次→沉淀酵母→加2倍体积5%酒石酸→离心水洗2次→离心干净啤酒酵母。经处理后,啤酒酵母呈乳白色,色泽好,无苦味。1.4.2酵母液的调成称取处理后的酵母45g(经试验含水分78%,实际相当于干酵母10g),加水调成10%酵母液。酵母液→盐处理→快速加热→抽提保温→迅速冷却→离心分离→上清液→等电点pH4.2沉淀蛋白质→离心分离→等电点pH2.5沉淀RNA→离心分离→乙醇洗涤→干燥→RNA干品。1.4.3r1测量RNA测定采用定磷法。1.4.4rna含量的计算准确称取标准RNA母液(须经紫外光度法测定其纯度)50.0mg,用少量0.05mol·L-1NaOH溶液湿透。用玻璃棒研磨至糊状的浑浊液,加少量蒸馏水混匀,调pH=7.0。再用蒸馏水定容至50mL,配得RNA含量为1mg·mL-1的溶液。标准RNA溶液:准确移取5.00mL标准RNA母液置于50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。此溶液含RNA为100μg·mL-1。RNA样品待测液:控制RNA浓度在10～100μg·mL-1范围内。取自制干燥RNA制品10mg,配制方法同标准RNA母液,定容至100mL,此溶液含RNA制品为100μg·mL-1。配制好的RNA样品经紫外分光光度计进行扫描,计算吸光度比值(260nm/280nm)。纯RNA溶液的A260/A280值为2.0,样品中若含有蛋白质,则A260/A280值要下降,因为蛋白质的最大吸收峰在280nm。1.4.5提取率计算提取率/%=提取RNA的质量/g干酵母的质量/g×100%/%=提取RΝA的质量/g干酵母的质量/g×100%2结果与讨论2.1单一因素研究2.1.1不同提取率的制备取上述处理的酵母悬浮液90g(含干酵母20g),加入破壁酶酶解后,加入氯化钠的量为10%,分别升温到60℃、70℃、75℃、85℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃,保温100min,冷却后离心,测定上清液中RNA含量,计算其提取率,结果如图1所示。由图1可见,随温度的提高提取率逐渐增加,当温度达到95℃时提取率达到最大,故后续试验采用的提取温度为95℃。2.1.2盐浓度对rna提取率的影响取上述处理的酵母悬浮液90g(含干酵母20g),升温到95℃,加热100min,分别加入氯化钠的量为1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%,冷却后离心,测定上清液中RNA含量,计算其提取率,结果如图2所示。由图2可见,氯化钠浓度达到10%时,RNA提取量达到最大。此后,盐浓度再提高,RNA提取量基本保持不变,趋于平衡。故后续试验采用氯化钠浓度为10%。2.1.3不同提取时间的rna提取率取上述处理的酵母悬浮液90g(含干酵母20g),升温到95℃,加入氯化钠的量为10%,分别加热10min、30min、60min、80min、100min、120min、140min、160min、180min,冷却后离心,测定上清液中RNA含量,计算其提取率,结果如图3所示。由图3可知,提取时间为120min时,RNA提取量达到最大。此后,再延长提取时间,RNA提取率几乎不发生变化。故后续试验控制提取时间为120min。2.1.4不同酵母中rna的提取率分别取浓度为2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%的酵母,升温到95℃,加入氯化钠的量为10%,加热100min,冷却后离心,测定上清液中RNA含量,计算其提取率,结果如图4所示。由图4可见,酵母浓度达到10%时,RNA提取率达到最大。此后继续增加酵母浓度,RNA提取率有所下降。2.2实验结果实验结果设计一个L9(34)正交实验,实验方案如表1所示。实验结果如表2所示。由表2可以看出,影响提取率的主次因素为:D>C>B>A,最佳工艺参数为A2B2C2D2。3不同浓度3ga酵母提取rna通过对RNA提取条件的研究,我们得到浓盐法提取啤酒酵母中RNA的较优提取条件:经预处理后的啤酒酵母,提取温度95℃,提取时间60min,