黄酒发酵过程微生物种群的多样性分析

黄酒发酵过程微生物种群的多样性分析

黄酒的发酵过程是在遵循原赛克郡细菌、细菌、发酵酶溶液中的乳酸杆菌（课余酒中的乳腺癌菌）和从酒药中引用的鞭毛霉、念珍珠细菌、糖化酶等革氏细菌、细菌、真菌和其他微生物分泌的酶系统的共同糖化、液化和分解的同时，以及不同品种、高密度的鞭毛菌和乳头菌（课余酒中的乳腺癌菌）之间的配合发酵过程。如传统工艺黄酒生产的主发酵醪中酵母菌数为5.0亿个/mL～9.0亿个/mL；乳酸杆菌数一般为2.0亿个/mL～3.0亿个/mL，部分为3.0亿个/mL～5.0亿个/mL，少量在5.0亿个/mL以上，耙前的缸心高达5.0亿个/mL～9.0亿个/mL。经笔者检测机械化生产黄酒的主发酵醪中酵母菌数一般为3.0亿个/mL～5.0亿个/mL，乳酸杆菌数一般为2.0亿个/mL～4.0亿个/mL。淋饭酒母制作过程酵母菌数为2.0亿个/mL～12.0亿个/mL，乳酸菌数（乳酸杆菌和乳酸球菌）为0.3亿个/mL～4.0亿个/mL。本文主要介绍黄酒发酵过程中主要成分的变化和酵母菌、乳酵杆菌的协同发酵关系。1主要组件的变化过程1.1糖化和除湿1.2酒精发酵1.3酸的生产1.4蛋白质分解1.5脂肪分解微量成分检测困难，变化更加复杂，但往往左右着黄酒的品质。2淀粉分解2.1淋炭酒搭窝糖化期糖化酶系统淀粉在从酒药中接入的拟内孢霉、念珠霉菌、乳酸球菌、能同化淀粉和糊精的酵母（拟内孢霉酵母以外的酵母，如糖化酵母等）为主，以毛霉、梨头霉、根霉等霉菌为辅，在产生的淀粉液化酶、糖化酶等酶系的作用下；笔者研究发现：淋饭酒搭窝糖化期是以拟内孢霉、念珠霉、乳酸球菌、糖化酵母的糖化分解作用为主，以根霉、梨头霉等为辅；而后在曲所提供的淀粉酶、糖化酶等的共同作用下，大部分淀粉被分解成葡萄糖，少量分解成糊精和低聚糖等；少部分是在乳酸球菌、拟内孢霉和部分乳酸杆菌分泌的酶系作用下分解或直接由部分乳酸杆菌利用而分泌多糖、葡萄糖等。尤其是在后发酵后期，这种作用更为明显，其它酵母也能分泌一些麦芽糖酶，分解和利用麦芽糖。2.2乳酸杆菌的分解淀粉在曲提供的和由部分乳酸杆菌产生的淀粉酶、糖化酶等的共同作用下，大部分分解成葡萄糖，少量分解成糊精和低聚糖等，或者少量淀粉由部分乳酸杆菌直接利用而分泌多糖、单糖。曲的糖化力在醪液中作用一定时间后，逐渐下降。如曲中的糖化酶在醪液中作用8h后，其糖化力剩60%左右，作用12h后，其糖化力剩50%左右，当作用时间延长到数10d以上，则其酶活力微弱或无活力，此后，剩余的淀粉和糊精的分解作用主要由部分乳酸杆菌来完成。虽然只有当酒精浓度达到18%（v/v）～20%（v/v），甚至以上时，霉菌的淀粉酶活力才开始受到酒精的抑制，但在醪液中，因作用时间长，受低pH、高乳酸量和其它因素影响较大，曲的液化力下降较快。在传统工艺的发酵过程中，乳酸杆菌的分解作用较大，曲提供的酶系和部分乳酸杆菌对淀粉的分解作用是相当的；后发酵期，尤其是后发酵的后期，剩余的淀粉和糊精的分解作用主要由部分乳酸杆菌来完成。在机械化生产的主发酵中，淀粉由曲（生麦曲、熟麦曲）提供的酶系的分解作用为主，部分乳酸杆菌的分解作用为辅；后发酵前期，剩余的淀粉、糊精的分解由曲提供的酶系和部分乳酸杆菌共同完成；后发酵后期，残余的淀粉和糊精主要由部分乳酸杆菌来完成。在黄酒发酵过程的主发酵期，乳酸杆菌对饭的液化起着重要作用。酵母也能分泌一些麦芽糖酶，分解和利用麦芽糖。淋饭酒和摊饭酒的发酵初期，糖的含量最高，随着酵母菌发酵产酒精和乳酸杆菌发酵产乳酸而逐渐降低，到发酵终了时，还残存着少量糊精、葡萄糖和非发酵性糖（异麦芽糖、潘糖等）等，这些非发酵性糖是由曲中的葡萄糖转移酶作用于部分单糖转化而成，或者由部分乳酸杆菌分泌。在压榨过程中，残余的糖化酶大部分进入酒液，而残余的液化酶吸附于饭粒上，留于糟粕。在澄清期，糖化酶和部分乳酸杆菌仅有少量作用，将部分糊精分解成糖分，促进酒的成熟。煎酒杀菌后，酶完全被破坏，酒质基本稳定。3大罐深层发酵过程在淋饭酒中，有些霉菌（毛霉、根霉等）和部分乳酸球菌、异型或兼性异型乳酸杆菌也能产生少量酒精；在摊饭酒的发酵醪中，霉菌几乎没有生长，几乎没有起作用，醪液中异型和兼性异型乳酸杆菌发酵也能产生少量酒精。大量的酒精主要是由酵母菌的发酵作用产生的，酵母菌在有氧条件下，以生长、繁殖等合成代谢为主；同时进行有氧呼吸，糖被分解为水和CO2，并释放大量的能量，反应式如下]。EMP途径：将葡萄糖分解为丙酮酸。三羧酸循环：丙酮酸彻底氧化为CO2和H2O。总反应式：在无氧条件下，将葡萄糖经EMP途径分解为丙酮酸，丙酮酸再由脱羧酶催化生成乙醛和CO2。乙醛在乙醇脱氢酶的作用下，被NADH2还原成乙醇。总反应式为：乳酸杆菌的异型乳酸发酵反应式为：还有少量的副产物：乙酸、甲酸、琥珀酸等。反应式中ATP的能量以热量形式释放出来。呼吸和发酵作用时产生大量的热，使醪液品温上升。主发酵初期，以酵母菌、乳酸杆菌的繁殖为主，发酵作用弱，品温上升缓慢。当醪液的酵母菌数和乳酸杆菌数达到一定程度时，进入发酵旺盛阶段。此阶段传统工艺酵母菌数多达5.0亿个/mL～9.0亿个/mL，乳酸杆菌数多达2.0亿个/mL～5.0亿个/mL；机械化生产的酵母菌数为3.0亿个/mL～5.0亿个/mL，乳酸杆菌数为2.0亿个/mL～4.0亿个/mL，发酵剧烈，品温上升很快。随着醪液中糖分减少，酒精含量增加，酵母菌、乳酸杆菌的发酵作用变弱，进入后酵阶段。在后发酵的前期，醪液pH继续降低，最低至pH3.3～3.5，因温度的降低，使酵母菌、乳酸杆菌相互之间或吸咐蛋白质、多酚、纤维素等物质而发生凝聚、沉淀。酵母菌、乳酸杆菌凝聚沉淀程度与本身的种类、温度和pH有关，pH越低、温度越低，酵母菌、乳酸杆菌的凝聚性越强，沉降越快。大罐深层发酵过程中，由于酒精度升高非常快，则pH3.8以下的时间非常短，后发酵温度较高，所用酵母菌种具有高发酵度，凝聚性较差。因此，酵母菌、乳酸杆菌凝聚沉降程度降低，悬浮的酵母菌、乳酸杆菌多，加速后发酵，使大罐深层发酵的后发酵期比传统工艺短。后发酵后期，当由曲带入的酶系活力降至很低或无活力时，醪液中剩余的淀粉和糊精的分解主要由部分乳酸杆菌来完成，提供给酵母继续发酵，促进酒精度持续升高；或者部分异型或兼性异型乳酸杆菌在发酵产乳酸的同时，使酒精的量有所增加。发酵结束榨酒时，加饭酒酒醪的酒精浓度可达18%（v/v）～20%（v/v），最高的达23%（v/v）。4阴酸、酸、酒，以脂肪酸为主在正常的发酵醪中，大部分有机酸是由乳酸杆菌发酵生成，少量是酵母菌产酒精过程的副产物和由米饭、酒母、曲、浆水等带入，极少量由霉菌和其它细菌生成。黄酒的有机酸中有60%～70%为乳酸，其它是乙酸、琥珀酸，还有少量的柠檬酸、酒石酸、草酸和酮酸等；无机酸以磷酸为主。这些酸对黄酒的呈香呈味和协调风味有很重要的作用。发酵结束，黄酒醪的酸度控制在6.56g/L左右，pH4.0左右为佳。酵母菌产酸量较小，它是在发酵产酒精时的伴生产物，经笔者测定：传统工艺黄酒酵母菌产酸量在0.90g/L～2.00g/L，机械化生产黄酒所用酵母菌种的产酸量在1.00g/L～1.90g/L。后发酵期，由于pH下降，保持一定时间后，又随酒精度的升高而缓慢升高。低温、高酒精度、低pH共同抑制乳酸杆菌的发酵产乳酸量，整个后发酵期，醪液的酸度升高幅度小。而且有部分有机酸被酵母同化产酯，以乙酯类为主。但是，当发酵工艺不符合要求时，醪液中乳酸杆菌的种类和比例发生改变，则易产生大量的乳酸和醋酸，使醪液酸败。又因后发酵后期，醪液的品温升高，耐高酒精度的乳酸杆菌活动能力加强，产乳酸的量增加，使醪液的酸度易超标。4.1dh2发酵工艺乳酸是黄酒的有效成分，是黄酒中有机酸的主要成分，也是黄酒酸败的主要成分。同型乳酸菌的发酵过程是：葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下，被NADH2还原成乳酸：总反应式：异型乳酸发酵也是先生成丙酮酸，而后还原成乳酸、乙醇、乙酸等。酵母菌（拟内孢霉）在生长、繁殖、发酵过程中也产生微量乳酸，酵母菌产乳酸量在500mg/L以下。淋饭酒中，前期糖化过程，拟内孢霉、乳酸球菌发酵产生一定量乳酸，因时间短，产乳酸量小；念珠霉、根霉等霉菌也产生极微量的乳酸；而后主要由乳酸杆菌发酵产生乳酸，酵母菌只产生微量乳酸。总体上说，淋饭酒中的有机酸（主要是乳酸）大部分由乳酸杆菌发酵产生。摊饭酒中，有机酸（主要是乳酸）也主要由乳酸杆菌在发酵过程中产生。4.2不同菌种所溶中氨基酸含量对发酵的影响琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、酒石酸、酮酸等有机酸是酵母菌在糖代谢过程中的副产物，上述酸中以琥珀酸居多，是构成黄酒风味的物质，而且与醪液中相对应的氨基酸含量有关，若醪液中谷氨酸含量增加，则可增加琥珀酸的产量。黄酒发酵醪中氨基酸含量高，尤其是后发酵后期，酵母菌、乳酸杆菌自溶分泌大量的氨基酸，因此其对应的有机酸产量也有所增加。另外，异型和兼性异型乳酸杆菌发酵也产生一定量的琥珀酸。因此发酵结束醪液中琥珀酸含量比其它非挥发性有机酸（乳酸除外）多。4.3中小糖酸发酵的影响酵母的糖代谢过程产生一定量的乙酸和其它脂肪酸，异型和兼性异型乳酸杆菌发酵也产生一定量的乙酸、甲酸，因此黄酒中挥发性酸以乙酸为主。若发酵工艺条件不符合要求，则异型和兼性异型乳酸杆菌发酵增强，产乙酸量大大增加。一般来说，发酵结束时，醪液中乙酸的含量是超过琥珀酸量的，但在榨酒、煎酒过程中，有大量的乙酸挥发，因此，成品黄酒中乙酸含量降低。另外，贮存过程中，因乙醇被缓慢氧化为乙酸，乙酸的量有所增加。4.4降压药对脂质中脂肪酸和甘油、胆固醇的代谢黄酒中无机酸以磷酸为主，其它无机酸很少。醪液中酵母菌、乳酸杆菌在繁殖过程中，必须进行磷脂的代谢，因为磷脂是细胞膜的组成部分。磷脂的代谢过程会产生一定量的磷酸、高级脂肪酸、甘油、胆碱。而在糖代谢过程中需要磷酸基作为能量转换物质，因此，在酵母菌、乳酸杆菌的体内贮存有一定量的磷酸，后发酵后期，酵母菌、乳酸杆菌自溶，释放一定量的磷酸。5小麦氨基酸的分类大米和小麦中含有一定量的蛋白质。米在浸渍过程中，其所含有的蛋白质少部分被乳酸杆菌和其它细菌分解为氨基酸。小麦所含有的蛋白质，在制曲过程被霉菌和细菌所分泌的蛋白酶、羧（基）肽酶分解成氨基酸。部分氨基酸被霉菌、细菌、酵母菌所利用合成菌体蛋白质，部分留在浆水和曲中。大米和小麦中的蛋白质在精米、浸米、制曲过程中有所减少。5.1蛋白质分解成氨基酸淋饭酒的搭窝糖化期，米饭中的蛋白质主要在酒药接入的拟内孢霉、念珠霉、乳酸球菌和少量的毛霉、梨头霉、根霉等霉菌所分泌的酸性蛋白酶、酸性羧（基）肽酶的作用下，把蛋白质分解成氨基酸，以乳酸球菌等的作用为主。放水、加曲后，曲所提供的酸性蛋白酶和少量酸性羧（基）肽酶也作用于蛋白质，分解成氨基酸。部分氨基酸被微生物利用合成菌体多肽和蛋白质，另一部分氨基酸被酵母菌利用代谢生成相应的高级醇、有机酸等，部分留在醪液中。淋饭酒的后酵期，剩余的蛋白质分解成氨基酸主要由乳酸杆菌分泌的酶系完成。而后，随着时间的延长，酒精浓度的升高，部分酵母菌自溶释放出大量的氨基酸，部分乳酸杆菌自溶释放出少量氨基酸和大量多肽。5.2发酵过程中乳酸杆菌和氨基酸的变化生麦曲的霉菌主要以根霉菌为主，还有梨头霉、黑曲霉、毛霉、米曲霉、红曲霉、大量的细菌、少量的酵母菌等。熟麦曲用米曲霉菌纯种培养而成；生麦曲中有以根霉菌和其他霉菌、细菌产生的大量酸性蛋白酶，主要由根霉菌产生，但比日本清酒米曲中的酸性蛋白酶活力3674单位要低得多。也有少量的酸性羧（基）肽酶，主要由黑曲霉、梨头霉、毛霉、米曲霉等和部分细菌产生，此酶活力相当低，但是存在。熟麦曲中的米曲霉能产生大量的酸性蛋白酶和酸性羧（基）肽酶，但比日本米曲的酸性蛋白酶活力3674单位和酸性羧（基）肽酶活力5109单位要低得多。尤其是在熟麦曲中的酸性羧（基）肽酶活力比日本米曲的酶活力低更多，但比生麦曲中酸性羧（基）肽酶活力要高很多（酶活力单位以μg酪氨酸生成量/h/g曲表示）。但我国黄酒生产中麦曲的酸性蛋白酶活力、酸性羧（基）肽酶活力合适。传统工艺主发酵过程，米饭中的蛋白质主要由曲提供的酸性蛋白酶分解为月示、胨、多肽，乳酸杆菌分解蛋白质能力较弱。月示、胨、多肽分解为氨基酸主要由乳酸杆菌完成，主发酵醪中乳酸杆菌密度高，分解月示、胨、多肽的能力强，因此，在主发酵醪中氨基酸含量较高，以后逐步提高。后发酵期，曲提供的酸性蛋白酶活力大幅度降低，因为霉菌的酸性蛋白酶活力受酒精浓度的影响较大，在酒精浓度达4%（v/v）～6%（v/v）以上时，酶活力就会损失一半。因此，在后酵期，曲所提供的酸性蛋白酶活力已很低，或已无活力，以后，剩余的蛋白质和月示、胨、多肽的分解作用主要由乳酸杆菌完成。机械化生产黄酒的主发酵过程，米饭中的蛋白质主要由生麦曲和熟麦曲所提供的酸性蛋白酶分解为月示、胨、多肽，乳酸杆菌的作用小。月示、胨、多肽分解为氨基酸是由熟麦曲所提供的酸性羧（基）肽酶和乳酸杆菌共同完成的，生麦曲中酸性羧（基）肽酶活力低，作用小。机械化生产中蛋白质分解作用比传统生产快，因此，机械化生产的主发酵初期起发快，主发酵期生酒精快。后酵期剩余的蛋白质和月示、胨、多肽的分解主要由乳酸杆菌完成。把米饭和小麦中的蛋白质分解为氨基酸，提供给酵母菌和乳酸杆菌合成菌体多肽和蛋白质，部分被酵母菌代谢生成高级醇、有机酸等，部分留在醪液中。随着发酵的进行，酒精浓度的升高，部分酵母菌和部分乳酸杆菌自溶，酵母自溶分泌大量氨基酸，乳酸杆菌自溶分泌少量氨基酸和大量多肽等，并促进耐高酒精浓度的酵母菌和乳酸杆菌继续发酵，使得黄酒中含有大量的氨基酸，且品种齐全，还含有大量的多肽。又因发酵醪液（主发酵、后发酵）中氨基酸含量高，能促进酵母菌发酵代谢，相应产高级醇的量大大增加，这就是黄酒的高级醇含量比其它酿造酒都高的主要原因之一。6小麦废水的预处理大米和小麦都含有2%左右的脂肪，浸米过程中，大米的脂肪含量随着部分乳酸杆菌和部分其它细菌的分解作用而减少。小麦的脂肪在制曲过程中随着部分霉菌的分解作用而减少。发酵过程中，原料的脂肪部分被乳酸杆菌分解，脂肪在脂肪酶的作用下分解成甘油和脂肪酸；甘油部分留在醪液中，部分被酵母菌、乳酸杆菌继续代谢或合成其他物质；脂肪酸受微生物酶的逐步β-氧化作用，进一步分解为低级脂肪酸，脂肪酸与醇结合形成酯。脂肪酸、甘油和酯是黄酒主要的风味物质。7糖液中多筛选出对含糖菌的真菌发酵过程头耙开出后，就很少能分离到霉菌。淋饭酒放水加曲，头耙开出后，醪液中也很少能分离到霉菌，搭窝糖化期的糖液中只分离到念珠霉菌，但数量很少。是因为醪液的低pH、高乳酸量、适量酒精、累积的乳酸杆菌素（或乳酸球菌素）和高糖度，共同抑制从曲、熟地中接入的霉菌及孢子的生长、繁殖，直到死亡。搭窝糖化期中，念珠霉菌的快速生长能抑制毛霉、根霉、梨头霉、青霉等其它霉菌的生长、繁殖，即其它霉菌在糖液中很少分离到。8母菌与乳酸杆菌之间的联合发酵关系8.1乳酸杆菌的发酵如前所述，酵母菌有氧代谢过程和无氧酒精发酵过程的关键物质为丙酮酸，乳酸杆菌代谢过程的关键物质也是丙酮酸。乳酸杆菌在发酵过程中分泌少量的丙酮酸，而温度的降低和酒精浓度的升高，部分乳酸杆菌自溶释放丙酮酸，被酵母菌直接利用快速合成和发酵产酒精，减少其生化步骤，这样促进酵母菌的繁殖、生长、发酵。同样，酵母菌自溶释放的丙酮酸直接利用快速合成和发酵产酒精，减少其生化步骤。同样，酵母菌自溶释放的丙酮酸也促进乳酸杆菌生长、发酵产乳酸。乳酸杆菌分解月示、胨、多肽或蛋白质产生大量氨基酸，促进饭的液化分解，大大促进酵母菌的繁殖、生长速度，从而促进发酵。酵母菌代谢分泌和自溶的大量氨基酸、核酸、维生素等生长因子，促进乳酸杆菌的生长。后发酵后期，剩余的淀粉和糊精的分解和月示、胨、多肽的分解主要由乳酸杆菌完成，从而促进酵母菌的继续发酵，使醪液累积的酒精浓度继续升高，可达20%（v/v）以上，是世界上所有酒精发酵和酿造酒中醪液累积酒精度最高的。乳酸杆菌分解脂肪为甘油和脂肪酸，甘油促进酵母卵磷脂的合成，卵磷脂是酵母细胞膜的重要组成部分，因而促进酵母的繁殖。乳酸杆菌发酵产乳酸，降低和维持低pH，同时，累积乳酸杆