曲酸对细菌的生物活性研究

曲酸对细菌的生物活性研究

曲线酸是一种含有酶分解的亲水酸，适用于食品加工。曲酸与目前在食品添加剂中广泛应用的苯甲酸、山梨酸及其盐类比有如下优点:水溶性好,无需先溶解于有机溶液中再添加到食品中;对人体无刺激性,并可抑制亚硝酸盐生成致癌物;不为细菌所利用,抗菌效力更强、更广泛。曲酸的抑菌作用和作为防腐剂的应用已有一些相关报道,本研究中针对曲酸对于食品中常见污染菌的抑制作用进一步进行系统研究,比较,确定了曲酸对各种供试菌的抑制程度及其相应最小抑菌浓度,从而为曲酸在食品方面的应用提供实验依据。1材料和方法1.1菌株salm细菌5种:大肠杆菌(Escherichiacoli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),猪伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi),铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);酵母2种:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),产朊假丝酵母(Candidautilis);霉菌2种:桔青霉(Penicilliumcitrinum),黑曲霉(Aspergillusniger),均为本学院微生物实验室保藏菌株。1.2金属丝样品由厦门市合成生物工程技术有限公司提供,经检测纯度>99%。1.3培养基(1)液体培养基细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基,酵母和霉菌采用5°P的麦芽汁作为培养基。(2)固体培养基用上述液体培养基加2%的琼脂制成。1.4无菌试验方法(1)细菌和发酵菌的激活将各供试细菌和酵母菌种分别接种于新配制的液体培养基中,适宜温度下(细菌37℃,酵母菌28℃)培养24h后,制成菌悬液。(2)培养基的制备分别取上述细菌、酵母菌的菌悬液2mL加入到装有60mL液体培养基(分别含有0.2%或0.3%的曲酸)的300mL三角瓶中,并以不加曲酸的培养基作为对照,37℃(细菌)或28℃(酵母菌)摇床培养,每隔6h测定一次吸光度值A560nm,连续测定9次。(3)角瓶培养基的制备将上述供试的桔青霉、黑曲霉斜面活化制成孢子悬浮液,摇匀后各取2mL接种到装有内含0.5%曲酸的60mL麦芽汁培养基的300mL三角瓶中,同样以不加曲酸的培养基作为对照。28℃摇床培养,每隔12h各取一瓶培养液,3000r/min离心10min,再用蒸馏水洗涤3次,105℃烘干至恒重,称量并计算菌体干重。1.5生长曲线测定mic值上述各细菌或酵母的菌悬液以及霉菌的孢子悬浮液分别取0.1mL涂布到含有不同曲酸量的平板上,37℃(细菌)或28℃(酵母菌、霉菌)下培养,每隔24h观察各平板菌落的生长情况并计算MIC值。曲酸浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。1.6曲酸平板的制备将浓度为2.5%的曲酸母液分别置于80℃、100℃和121℃处理30min后,定量加入到各培养基中,制成含0.2%和0.4%的曲酸平板,同MIC测定法进行抑菌比较试验。1.7平板式菌株的制备采用滤纸圆片法。圆滤纸片是将102型滤纸用打孔器制成直径为10mm的圆片,121℃灭菌后备用。上述各菌株的菌悬液或孢子悬浮液0.1mL加入各适温培养基,倾注平板后,用无菌镊子将分别在1%曲酸溶液或1%苯甲酸钠溶液中浸泡10min的滤纸片贴注平板,并以无菌水作为对照。每菌株平行3个平板,37℃(细菌)或28℃(酵母菌、霉菌)培养24h(细菌)和48h(酵母菌、霉菌)后,观察抑菌效果并测量抑菌圈大小。2结果与讨论2.1曲线酸的抗菌性2.1.1曲酸对铜绿假单胞菌生长和抑制作用的影响实验首先采用分光光度法比较了曲酸对于4种经常性引起食品污染的细菌大肠杆菌、猪伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制作用效果,结果如图1～图4所示。从图1～图4的动态观察测试结果可以看出,曲酸对这4种细菌均有明显的抑制作用,且随着曲酸的浓度提高,抑菌作用效果逐渐加强。这其中,曲酸对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌能力明显强于对革兰氏阴性的大肠杆菌和猪伤寒沙门氏菌的抑菌能力。当曲酸浓度为0.2%和0.3%时,革兰氏阴性菌在培养过程中仍有一定生长,而革兰氏阳性菌,特别是铜绿假单孢菌几乎不生长,2菌体生长曲线基本上重合在一起。为了进一步研究曲酸对铜绿假单胞菌的抑制作用,把曲酸的浓度降低到0.1%和0.05%,实验结果见图5。从图5低浓度曲酸对铜绿假单胞菌的抑菌曲线中可以看出,曲酸对铜绿假单胞菌的抑菌功能最好,0.1%的曲酸就可以起到根本性地抑制铜绿假单胞菌生长的良好作用效果。另外,图6和图7表示了曲酸对于2种酵母菌啤酒酵母、产朊假丝酵母菌生长抑制作用的分光光度法试验结果。从图7结果可见,曲酸对产朊假丝酵母有较好的抑制作用,0.3%曲酸呈现出明显的作用结果。但对于啤酒酵母,实验观察到尽管在摇床培养液中加入了一定浓度的曲酸,但是随着时间的延长也会跟未加曲酸的对照培养液一样,很快变为混浊。在培养18h后,添加曲酸的试样和未加曲酸的对照组同样都要经过稀释30倍才能测出其吸光度值A560nm,这说明浓度为0.3%的曲酸对啤酒酵母的抑制作用不明显。实验后来发现0.8%和1.0%浓度的曲酸可以表现出对啤酒酵母菌体生长的明显影响作用。2.1.2曲酸对设计植物的抑制作用实验随后采用菌体量法比较了曲酸对桔青霉和黑曲霉的抑制作用,其结果见图8和图9。从图8和图9可见,当培养液中曲酸的浓度为0.5%时,桔青霉和黑曲霉试验组的菌体量曲线与未加曲酸的对照组曲线几乎完全相重合,表明曲酸对桔青霉和黑曲霉的生长不施加任何抑制作用,有报道称包括曲霉和青霉的多数丝状真菌能在通常条件下合成产生一定量的曲酸,因而在菌体细胞内可能已经形成了相应的曲酸对抗或耐受机制体系,上述现象可能与此有关。2.2曲酸对三种细菌生长的影响选用大肠杆菌、猪伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、啤酒酵母菌、桔青霉和黑曲霉8种菌,测定曲酸抑制的MIC,结果见表1。与上面结果一样,虽然曲酸未能表现出对于青霉和黑曲霉菌体生长的影响作用(在最高试验浓度为0.6%情况下效果也很不明显),而对于啤酒酵母,曲酸浓度需高达0.5%时,方有较好的抑制作用,其MIC定为0.5%。但是,当培养基中曲酸含量达到0.3%时,曲酸对于其他各供试菌均有很好的抑菌效果,其中,曲酸对铜绿假单胞菌的抑制作用最显著,0.1%就能达到很强的抑制作用,但从其完全抑制该菌生长的实验结果上看,可以确定其MIC为0.2%。对其他3种细菌大肠杆菌、猪伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌也表现出尚佳的抑制效果,MIC分别为0.3%、0.4%和0.4%。同样,曲酸对假丝酵母的抑菌效果也较好,MIC为0.2%浓度的曲酸就能达到彻底的抑菌作用。2.3曲酸对细菌和酵母菌生长的影响从表2可以看出,曲酸经80℃、100℃和121℃处理30min后,再以上述MIC测试方法进行抑菌实验的结果显示,热处理后曲酸的抑菌效果与未经热处理的曲酸的抑菌效果相同,仍有良好的抗菌效力,说明曲酸对热稳定性良好,可与加工食品共同加热灭菌,这对曲酸在各种食品中的实际应用十分有利。由表3知,与曲酸一样,相同1%浓度的苯甲酸钠亦未能呈现出对于曲霉和青霉的任何抑制作用,但是,曲酸抑制细菌和酵母菌繁殖生长的能力明显强于苯甲酸钠。苯甲酸钠不能对于酵母菌的生长给予任何可观察到的有效影响,而曲酸则对产朊假丝酵母表现出非常清楚的抑菌效果,对啤酒酵母也有一个微小的作用结果。并且曲酸能够对于苯甲酸钠不能起到影响能力的猪伤寒沙门氏菌呈现出了清晰透亮的抑菌圈,同为革兰氏阴性菌的大肠杆菌,其抑菌圈直径超过了11mm。在其他细菌的抑菌圈直径上,二者之间也至少存在0.5mm以上的距离差别,即苯甲酸钠与曲酸的抑菌作用效果浓度之间,大约相差0.1%以上的等级差异。2.4结果采用滤纸圆片法对曲酸和苯甲酸钠的抑菌能力进行了试验比较,结果如表3所示。另外,实验中为了防止琼脂不凝固,培养基pH都调为中性,而曲酸和苯甲酸钠的抑菌效果在酸性或偏酸性的条件下才较强,所以,本实验也说明曲酸的抑菌pH范围较广。3曲酸及抗菌活性(1)曲酸对食品中常见的细菌、酵母菌有较好的抑制作用,特别对细菌的抑制效果更明显,0.2%～0.4%的曲酸就能对各供试细菌起到很好的抑制作用。曲酸对铜绿假单胞菌的抑制作用显著,0.1%就能达到很强的抑制作用;曲酸对产朊假丝酵母有较好的抑制作用,0.2%的曲酸可以