大孔树脂分离纯化三苦滴丸中三七总皂苷的研究

大孔树脂分离纯化三苦滴丸中三七总皂苷的研究

三苦滴丸是三七和苦麦碱的提取物。它具有活血化瘀、通脉痛的功效。用于冠状动脉粥样硬化、心绞痛和心血郁结。本文主要对三苦滴丸中的三七总皂苷的纯化工艺进行研究,为三苦滴丸的开发利用提供科学的工艺参数。1天津农药有限公司三七药材(长春市宏检药店)、D101(天津农药股份有限公司树脂分公司)、AB-8(南开大学化工厂)、NKA(南开大学化工厂)。2实验方法2.1乙醇的制备新树脂加等量乙醇浸泡24h,湿法装柱,再用乙醇浸泡4h,加乙醇洗至流出液加水不呈白色浑浊为止,再用蒸馏水洗净乙醇。加入5%盐酸溶液,浸泡6h,洗脱,再用水洗至中性。加2%氢氧化钠溶液浸泡6h,洗脱,再用水洗至中性,即得。2.2用热法提取准品溶液精密称取三七总皂苷标准品(批号870-200001中国药品生物制品检定所)8.26mg置5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得标准品溶液。精密量取上述标准品溶液20,40,60,80,100μL,分别置10mL具塞试管中,水浴蒸干,另取一支10mL具塞试管做空白,分别精密加入新配置的5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸溶液0.8mL,摇匀,置60℃水浴中加热15min,冰水冷却,加冰醋酸5mL,摇匀,即得。按分光光度法,在552nm测量上述溶液的吸收度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,Y=0.0288X-0.0052,r=0.9998,结果表明,浓度5.5～27.5μg/mL与吸收度线性关系良好。2.3提取乙醇制备组取三七药材,粉碎成10mm以下颗粒,加4倍量60%乙醇提取3次,每次2h,滤过,合并滤液,回收乙醇,浓缩至1g药材/mL药液,备用。2.4测定了三七总羟基糖的含量精密吸取上述供试品溶液40μL,分别置10mL具塞试管中,按“2.2”项操作,测定并计算总皂苷含量。2.5不同树脂对三公总皂苷的等温吸附取上述经过预处理后的3种树脂各2份,每份10g,取其中一份干燥至恒重,另一份分别加三七提取液40mL,浸泡24h,前6h每隔1h搅拌1次,滤过,用适量蒸馏水冲洗,与滤液合并定容至50mL量瓶中,测定其中总皂苷的量,计算各种树脂对三七总皂苷的吸附量和吸附率。2.6皂苷提取液上柱的制备将预处理好的树脂装入玻璃层析柱中,将皂苷提取液上柱,控制一定流速,分步收集,当流出液吸光度达上样液的1/10时,认为皂苷已透过,停止上样,计算吸附量。3结果3.1孔树脂的选择由上述试验结果可知,D101型树脂静态吸附量明显高于AB-8、NKA型树脂,所以我们选择D101型树脂为三七提取物纯化用树脂。3.2对树脂总羟基的动态吸附过程参数的研究3.2.1树高比的确定分别称取D101湿树脂40g,装入不同内径的树脂柱中,量取高度,计算“径高比”,取已知含量的三七提取液60mL3份,分别上柱,先用6BV蒸馏水洗脱,再用6BV60%乙醇溶液洗脱,收集300mL洗脱液,测定其中三七总皂苷的量,结果选择装树脂柱的“径高比”为大约1∶8。3.2.2提取液的上柱分别称取D101湿树脂3份,每份40g,湿法装柱,径高比“1∶8”,取不同浓度的三七提取液分别上柱(1号:0.5g药材/mL;2号:1.0g药材/mL;3号:1.5g药材/mL),上柱生药量均为30g,上柱速度2BV/h,用6BV水洗脱杂质,再用6BV60%乙醇溶液洗脱,收集300mL洗脱液,结果选择0.5g药材/mL药液浓度上样。3.2.3上柱流速bv/h分别取经预处理过的D101大孔湿树脂40g,共4份,湿法装柱,精密吸取三七提取液60mL上柱,上柱流速2BV/h。先用6BV蒸馏水洗脱,再用6BV不同浓度乙醇溶液洗脱,分段收集洗脱液,每段50mL,测定其中三七总皂苷的量,结果从洗脱液中总皂苷的总量来看,60%乙醇与70%乙醇洗脱总皂苷的量相差不多,且60%乙醇对生产成本有利,所以我们选择以60%浓度乙醇为洗脱剂。3.2.4上样速度的确定取经预处理的D101大孔湿树脂共3份,每份40g,装树脂柱,“径高比”1∶8,吸取三七药材提取液3份,每份60mL,以不同速度分别上样,先用6BV蒸馏水洗脱,再用6BV60%乙醇溶液洗脱,洗脱速度6BV/h,收集300mL乙醇洗脱液,测定洗脱液中总皂苷的量,结果选择上样速度为2BV/h。3.2.5洗脱时间的确定取经预处理的D101大孔湿树脂共3份,每份40g,装树脂柱,“径高比”1∶8,吸取三七药材提取液3份,每份60mL,上样速度2BV/h,分别吸附不同的时间后,先用6BV蒸馏水洗脱,再用6BV60%乙醇溶液洗脱,收集乙醇洗脱液300mL,测定洗脱液中总皂苷的量,结果吸附时间为2h与3h洗脱总皂苷的量相差不大,所以选择吸附2h。3.2.6洗脱速度对总皂苷量的影响取经预处理的D101大孔湿树脂共3份,每份40g,装树脂柱,“径高比”1∶8,吸取三七药材提取液3份,每份60mL,上样速度2BV/h,吸附2h后,先用6BV蒸馏水洗脱,再用6BV60%乙醇溶液分别以不同速度洗脱,收集乙醇洗脱液300mL,测定洗脱液中总皂苷的量,结果4BV/h与6BV/h洗脱总皂苷的量较8BV/h洗脱的量高,但考虑到4BV/h与6BV/h洗脱的量相差不大,为提高生产周期选择洗脱速度为6BV/h。3.2.7洗脱溶剂用量取经预处理过的D101大孔湿树脂40g,湿法装柱,精密吸取三七提取液61.5mL上柱,提取液上柱浓度为0.5g药材/mL,上柱流速2BV/h,吸附2h,用蒸馏水洗脱,连续收集洗脱液,每50mL为1份,当洗脱液收集到第6份时已接近无色,将洗脱液浓缩、干燥至恒重,结果当连续收集洗脱液至第6份时,干燥物重量极少,说明已经基本洗脱完全,所以洗脱用蒸馏水用量为250mL。即每40g湿树脂吸附药材提取液后用5BV水洗脱。4脂质树纯化