两种试剂盒提取星普液体微量dna的比较

两种试剂盒提取星普液体微量dna的比较

随着人类组的建立，对人类健康的严重疾病的易感基因研究已成为国际生物学领域的研究重点。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)作为一种遗传学标记,自产生之初就以其分布广泛、稳定和容易鉴定等特点而逐步取代微卫星,成为研究基因组稳定性和识别、定位疾病相关基因的新一代遗传标记。近年来,各种高通量的SNP分型方法相继问世,但可获得的遗传资源有限,如何获得高质、高量的基因组DNA已经成为迫切需要解决的问题。常用的DNA提取方法有微量碱变性法、酚-氯仿抽提法和氯化钠盐析法等。目前,已有许多商品化的试剂盒问世并获得广泛应用,大大加速DNA提取过程,提高产量和质量。但是,对于长期冷冻保存的外周血,各种试剂盒的提取效果均不佳。本研究通过比较国产星普液体微量DNA提取试剂盒(SLDPK)和PromegaWizardGenomicDNA提纯试剂盒(PWGDPK)提取DNA的效果,探讨从冷冻保存的人外周血中提取基因组DNA的最佳方案。1材料和方法1.1材料和试剂PWGDPK购自Promega公司(美国)。SLDPK购自宁波星普基因技术有限责任公司。1.2基因组dna的提取12例健康成人外周血,-20℃冻存1年,期间反复冻融3次。分别采用两种试剂盒提取基因组DNA。(1)PWGDPK提取基因组DNA:向1.5mL离心管中加入900μL细胞裂解液,将提前融化的血充分混匀后取200μL加入试管中,吹打混匀,室温反应15min(每2~3min颠倒混匀1次),13000r·min-1离心3min。吸弃上清,加入300μL核裂解液,反复吹打直至团块全部溶解,37℃水浴30min。加入1.5μLRNase(4g·L-1),充分混匀,37℃水浴15min。加入100μL蛋白沉淀液,充分混匀,室温反应5min后离心(同前),将上清移到预先加入300μL异丙醇的1.5mL离心管中,上下反复颠倒混匀,室温反应15min后离心(同前),管底可见白色沉淀,轻轻倒弃上清,用吸水纸吸干。加入70%乙醇200μL洗涤1次,离心(同前),轻轻倒弃上清,用吸水纸吸干,室温干燥20min。加入100μLDNA溶解液,65℃水浴2h,4℃保存。(2)SLDPK提取基因组DNA:取200μL全血加入1.5mL离心管中,加入20μL蛋白酶。在振荡中加入200μLB1试剂,继续振荡10s,室温反应10min。在振荡中加入200μLB2试剂,继续振荡10s,充分混匀。将混合液转移到套有接液管的旋转离心柱中,13000r·min-1离心2min。将接液管中液体倒掉,在旋转离心柱中加入300μLB3a试剂,同样离心。将液体倒掉,在旋转离心柱中加入500μLB3b试剂,离心。将液体倒掉,空柱离心2min。将旋转离心柱转移到干净的1.5mL离心管中,加入100μLB4试剂,室温静置10min后离心,4℃保存。1.3两种试剂盒提取的基因组dna浓度比较采用BECKMANDU640型紫外分光光度计分别测量基因组DNA的A260和A280的吸光度值。每个样品均先向石英杯中加入双蒸水调零值,再加入DNA样品,读取A260和A280的吸光度值。PWGDPK提取的DNA采用200倍稀释后测定吸光度,而SLDPK采用100倍稀释后测定吸光度。根据公式计算基因组DNA的浓度,比较两种试剂盒提取的基因组DNA产量和质量的差别。DNA浓度C(mg·L-1)=A260/0.020×稀释倍数。1.4基因组dna上样和电泳称取0.5g琼脂糖,用50mLTBE配成1%的琼脂糖凝胶。每孔5μL基因组DNA上样,DL2000DNAmarker为分子量标准,80V恒定电压电泳30min,溴化乙锭染色,BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相和保存。1.5s1265的构建应用Primer3软件设计引物,对含有rs1171558和rs2248745两个SNP的DNA片段分别进行PCR扩增。rs1171558的引物序列为F:5′-TGGACGACAGCAGACTCTTG-3′;R:5′-CACTGGTATACATGCCCCTTG-3′。rs2248745的引物序列为F:5′-GGGTCTGAGCT-GTCTCTCCA-3′;R:5′-CCCTGGTCACTTGT-TGTCCT-3′。PCR反应总体系为25μL,其中包括:10×buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.8μL,上、下游引物(8pmol·μL-1)各1μL,TaqDNA聚合酶1.75U,基因组DNA模板2.0μL用ABI2700型PCR仪进行PCR扩增,循环条件为:94℃5min,(96℃45s,62℃1min,72℃45s)×3;(95℃45s,60℃1min,72℃45s)×5;(94℃45s,58℃1min,72℃45s)×32;72℃10min。取PCR产物5μL,用1.5%琼脂糖凝胶电泳,DL2000DNAmarker为分子量标准,溴化乙锭染色,应用凝胶成像系统照相和保存。1.6统计处理2结果2.1sldpk提取的dna的提取通过测量两种试剂盒提取的DNA样品的吸光度值A260和A280,分别计算A260/A280比值和基因组DNA浓度。结果见表1。12个外周血样品,用PWGDPK提取的DNA浓度在15.0~130.0mg·L-1之间,平均值74.8mg·L-1,样品间的差别较大,标准差39.3mg·L-1;SLDPK提取的DNA浓度在15.5~37.0mg·L-1之间,平均值26.6mg·L-1,样品间的差别较小,标准差6.2mg·L-1。经配对设计的t检验分析,用PWGDPK提取的DNA产量显著高于SLDPK(t=4.119,df=11,P<0.005)。此外,PWGDPK提取的DNA的A260/A280平均值为1.69,标准差为0.30;SLDPK提取的DNA的A260/A280平均值为1.69,标准差为0.36。提示两种试剂盒提取的基因组DNA纯度都不高,都有较多蛋白质混杂,两组间差异无显著性(t=0.066,df=11,P>0.05)。2.2dna浓度和测量方法的比较两种试剂盒提取的基因组DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图1。下方用PWGDPK提取的12个基因组DNA样品,除3、5和9外,其余的样品条带都较深,与吸收光谱法计算的DNA浓度结果基本一致;上方用SLDPK提取的12个样品,1~7可见较浅的电泳带,8~12基本上看不见电泳带,也与吸收光谱法计算的DNA浓度结果基本吻合,证实前者提取的DNA产量高于后者。2.3pcr产物的分析应用两种试剂盒提取的基因组DNA作为模板,对含有rs1171558和rs22487452个SNP位点的DNA片段分别进行PCR扩增。图2显示的是rs1171558位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果,上方和下方分别以SLDPK和PWGDPK提取的基因组DNA作为模板,PCR产物长176bp。在12个样品中,两者均有11个样品(91.7%)获得目的片段,未见明显差别。图3显示的是rs2248745位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果,上、下方同上,PCR产物长183bp。在12个样品中,应用SLDPK只有4个样品(33.3%)获得目的片段;应用PWGDPK有10个样品(83.3%)获得目的片段,明显优于前者。3反复冻融法提取的基因组dnaDNA提取是裂解细胞膜、细胞核后提取核酸、去除蛋白质、脂类和多糖等物质的过程,作为一种常规技术在分子生物学研究中发挥着举足轻重的作用。PWGDPK和SLDPK的原理完全不同。PWGDPK可用来从白细胞、培养细胞、动物组织及酵母等中提取DNA,其原理主要是先溶解细胞及细胞核使DNA释放,之后用RNA酶消化RNA,用盐沉淀液去除蛋白,最后用异丙醇沉淀DNA;SLDPK是利用旋转离心柱从各种液体样品(包括血液、体液等)中快速提取高纯度的DNA,其原理是采用细胞裂解液破碎细胞并利用旋转离心柱内的固态膜选择性地吸附DNA。当样品经细胞裂解处理后,加入离心柱内,通过高速离心,DNA能被高效选择性地吸附在固态膜上,而绝大多数杂质(蛋白质、糖类、脂类和盐等)均可通过固态膜被离心掉,再经两次离心洗脱将残留在固态膜上的微量杂质(主要是二价阳离子和一些杂蛋白等)除去,最后用低盐中性缓冲液洗脱下高纯度的DNA。本研究采用反复冻融3次并在-20℃冻存1年的12例健康成人外周血样品,分别应用上述两种试剂盒提取基因组DNA,并采用吸收光谱法、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增等方法分别对提取的基因组DNA进行对比鉴定。吸收光谱法主要是基于核酸、蛋白质和盐类小分子对紫外线吸收不同的特性,三者分别在260、280和230nm处有最大吸收峰。因此,溶液中DNA的含量可以通过260nm处的光吸收值(A260)计算,而DNA溶液中蛋白质和盐类小分子的混杂程度可以通过比较其在260nm处的光吸收值(A260)与其在280nm处的光吸收值(A280)来判断。理论上,基因组DNA的A260/A280的比值应该位于1.8~2.0之间。本研究中,就两种试剂盒提取的基因组DNA的含量而言,PWGDPK提取的DNA浓度在15.0~130.0mg·L-1之间,而SLDPK在15.5~37.0mg·L-1之间,前者显著高于后者,就基因组DNA的纯度而言,A260/A280比值的分析表明,两种试剂盒提取基因组DNA的A260/A280比值大都偏离了1.8~2.0范围,纯度均不高。基因组DNA琼脂糖凝胶电泳可以直观地反映DNA的含量,本研究结果显示,PWGDPK提取的DNA产量高于SLDPK。在此基础上,在基因组中随机选择了2个SNP位点,用PCR方法进一步分析比较两种试剂盒提取的基因组DNA的质量差别。rs1171558位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果表明,两种试剂盒提取的基因组DNA进行PCR反