响应面法优化固态发酵豆粕制备大豆肽的条件

响应面法优化固态发酵豆粕制备大豆肽的条件

豆豆是目前鸟类最重要的植物蛋白来源。其粗蛋白含量为43%48%，是一种相对平衡的氨基酸，尤其是其他植物饲料中的氨基酸含量为2.5%2.8%。但大豆蛋白质分子结构复杂,分子量较大,从而导致消化率和生物学效价不高;同时豆粕中还存在多种抗营养因子,极大地影响了豆粕的饲用价值。通过生物转化处理可有效地降低去除豆粕中的各种抗营养因子,同时使豆粕中的蛋白质分解成大量的植物小肽,即大豆肽。大豆肽是大豆蛋白质经过控制性的水解、精制得到的一类活性肽,通常是由3~6个氨基酸组成的低分子量肽。这种无抗原的植物小肽吸收率高,可作为许多高档经济动物的优良蛋白质来源。常见的大豆肽的生物转化方法有酶解豆粕和发酵豆粕。酶解豆粕主要用于大豆肽的液态生产,它存在一定的限制因素,主要表现在蛋白质水解过程中产生的苦味、臭味无法完全抑制,尤其是大规模生产中,降低和脱除水解过程中的苦味和臭味需要很高的成本。固态发酵不仅可以应用于液态生产不能实现的过程,而且可以弥补液态生产的不足与缺陷。应用现代固体发酵技术实现规模化生产成本往往比液态法要低,更重要的是豆粕经固态发酵可有效提高蛋白质的生物转化率。目前国内外微生物发酵豆粕生产大豆肽的发酵方式主要集中于单一菌种的发酵和发酵菌株的筛选,而复合菌株的协同发酵研究甚少,并且该方面的研究是豆粕固态发酵中的一个难点。因此,笔者以普通豆粕为原料,采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和啤酒酵母的二元复合菌进行固态发酵,通过单因素试验及其中心组合设计试验研究不同因素对豆粕发酵对大豆肽含量的影响,以期获得高大豆肽含量的发酵产品,从而提高大豆生产的附加值。1材料和方法1.1菌种组合与培养基原料:豆粕、麸皮,购于芜湖市大砻坊希望饲料有限公司。其中豆粕含水量为13.3%,粗蛋白含量为44.21%,小肽含量1.45%(干基)。菌种:黑曲霉(Aspergillusniger),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均为安徽工程大学生物技术专业实验室保藏菌种。试验中用H、K和P分别表示黑曲霉、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌种,利用KH、PH和KP表示该3种菌种组合。培养基:马铃薯蔗糖培养基(简称PDA),用于黑曲霉和啤酒酵母的分离平板及斜面、啤酒酵母的液体种子培养;牛肉膏蛋白胨培养基(简称LB),用于枯草芽孢杆菌分离平板及斜面、枯草芽孢杆菌的液体种子培养。基础发酵培养基:45g豆粕+5g麸皮+0.15gMgSO4,其含水量为50%。主要检测试剂:茚三酮溶液(5.0mg·mL-1)、氨基酸贮备溶液(0.2mg·mL-1)、氨基酸标准使用液(20μg·mL-1)。1.2测试方法1.2.1酵母菌种培养将枯草芽孢杆菌、啤酒酵母分别接入各菌种的液体培养基中,枯草芽孢杆菌于30℃振荡培养48h,啤酒酵母菌于28℃静置培养48h;并以培养好的菌液为菌种,按2%接种量接到各菌种发酵种子液培养基中扩大培养24h,制成发酵种子液(注:黑曲霉不进行液体发酵,而是采用洗孢子的方式制备菌液)。1.2.2大豆肽的测定方法大豆肽浸提:在发酵样品中加150mL的蒸馏水,在80℃水浴中分3次浸泡提取,每次大约40min左右,然后将样品进行过滤分离,废渣再加水继续浸泡提取过滤分离,提取3次,最后合并滤液加水至350mL,即可得到样品的大豆肽粗提取液。沉淀:取3mL滤液于离心管内,另加3mL20%TCA摇匀静置15min。离心:将静置液于5000r·min-1转速下离心15min,离心后取上清液于另一离心管中保存待测。1.2.3大豆肽的测定标准曲线绘制:精确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0mL甘氨酸标准溶液分别置于9个试管中;并分别加2.0mL茚三酮显色剂溶液,再加蒸馏水稀释至10mL,摇匀。然后置于沸水浴中加热20min,产生蓝紫色后,流水冷却至室温,于570nm处测定吸光度,并绘制甘氨酸溶液标准曲线。其方程为Y=0.0457X+0.0371(R2=0.9921)发酵液中大豆多肽含量的测定:取1.0mL样品保存液于试管中,调节pH至5~7,然后向试管内加入2.0mL茚三酮溶液,再于沸水浴加热20min,冷却后于570nm下测定吸光度,根据标准曲线方程计算大豆多肽含量。该试验大豆肽含量的计算公式为:H%=A*n*3*2*350/45000000×100%(H%:大豆肽含量;A:所测OD值通过曲线方程求得的大豆肽浓度;n:稀释倍数)。1.2.4大豆肽的制备将基础发酵培养基灭菌后,按2∶1,1∶1和1∶2接种比例分别接入KH、PH和KP3种组合菌种,接种量为20%,置于30℃的摇床中培养48h后,测定发酵样品大豆肽含量;得到的最佳菌种组合及其接种的菌种比例,用于接种量、发酵时间、基质初始含水量以及发酵温度对豆粕发酵大豆肽含量影响的研究,具体设计见表1。1.2.5最优菌种组合正交试验根据单因素试验的结果,选取3个影响较大的因素,采用SAS8.2统计软件设计中心组合试验,并对试验数据进行回归分析,从而得出最优菌种组合的最优发酵条件。2结果与分析2.1不同菌种组合对发酵豆浆中大豆肽的分离效果图1为不同组合菌种的接种比例对豆粕发酵产生大豆肽的影响。从中可以看出,组合菌种中,接种比例不同,发酵产物中大豆肽含量存在一定的差异。对于KH组合菌种,当枯草芽孢杆菌与黑曲霉的接种比例为2∶1时,大豆肽含量最高,发酵后基质上能够看到黑曲霉生长的孢子和菌丝体,并且基质有结块现象;对于PH组合菌种,当啤酒酵母与黑曲霉的接种比例为1∶1时,大豆肽含量最高,且发酵后基质上同样能够看到黑曲霉生长的孢子和菌丝体,基质有结块现象,并有曲香气味产生;对于KP组合菌种,当枯草芽孢杆菌与啤酒酵母的接种比例为2∶1时,大豆肽含量最高,发酵后产物略有结块现象,其表面有一层白色菌体,并有曲香产生。另外,从图1中还可以看出,二元组合菌发酵豆粕产生大豆肽的含量均明显高于单菌;3种单菌中以枯草芽孢杆菌产生的大豆肽含量最高,而黑曲霉发酵产生大豆肽的能力较差。比较3种组合菌种,可知KH菌种组合发酵豆粕生产的大豆肽含量高于PH和KP菌种组合。因此,选用KH组合菌种,并按照2∶1接种比例的进行下列优化试验。2.2接种量对大豆肽含量的影响图2为接种量对豆粕发酵产品中大豆肽含量的影响。随着接种量的增加,发酵产品中大豆肽含量先增加后降低。当接种量为25%左右时,发酵产品中大豆肽含量达最大值,继续增加接种量,大豆肽含量反而下降。可能原因是由于接种量过大,致使菌体生长速度加快,从而消耗大量的营养物质。因此,产品中大豆肽的含量呈现下降趋势。2.3发酵时间对大豆肽含量的影响图3为发酵时间对豆粕发酵产品中大豆肽含量的影响。在发酵初期,随着发酵时间的延长,产品中大豆肽含量逐渐增加,当发酵时间为48h左右时,产品中大豆肽含量最高。继续延长发酵时间,反而会使大豆肽含量减少。可能原因是随着发酵时间的延长,微生物会发生自溶现象;另外,前期提供的C、N源已经耗尽,因而菌体生长所需营养需靠大豆肽提供,从而导致大豆肽含量下降。因此,在实际的生产中,发酵周期不宜过长。2.4达到最高值固态发酵过程中,只有适度的水分才能催化蛋白酶的活力,从而使发酵产品中大豆肽含量达到最高值。图4为基质含水量对豆粕发酵产品中大豆肽含量的影响。可以看出,在发酵初期,随着含水量的增加,产品中大豆肽含量逐渐增加,当含水量为55%左右时,产品中大豆肽含量最高,之后又有降低趋势,说明55%含水量的培养基质适宜微生物生长繁殖。2.5最适温度的确定细菌的最适生长温度高于真菌的最适生长温度,因此,混菌发酵的最适温度并不一定就是各单菌各自生长的最适温度。由图5可以看出,随着发酵温度的增加,大豆肽含量也不断增加,当温度为34℃时,大豆肽含量达到最大值,继续增加温度,大豆肽含量反而减少。2.6发酵条件对大豆肽含量值的影响根据以上单因素试验结果,确定接种量、发酵温度、含水量为3个对大豆肽含量影响较大的因素,进行三因素三水平共15个试验点Box-Behnken中心组合设计试验,其因素水平选取见表2,试验方案与结果见表3。表4为KH组合菌种豆粕发酵大豆肽含量的回归模型方差分析表。从中可以看出,响应面模型总体P<0.01,说明该模型达到极显著水平;模型的复相关系数R2=0.9501,说明该回归方程可以准确地预测不同发酵条件对大豆肽含量值的影响;方程的一次项和二次项均达到显著和极显著水平,说明发酵条件对大豆肽值有显著影响;方程的交互项也达到极显著水平,说明各发酵条件之间相互影响显著,有较强的交互性。以X1、X2、X3分别表示接种量、发酵温度、含水量3个变量,以Y表示响应值(大豆肽含量),经回归分析,Y与X1、X2、X3的关系可用方程:Y1=7.995535+0.196993X1+0.929823X2-0.541465X3-0.412949X1X1+1.199674X1X2-0.087308X1X3-2.536841X2X2-0.707658X2X3-1.05712X3X3表示。由表4中方差分析可以看出,该模型的失拟项P=0.246>0.05,差异不显著,表明该方程对试验结果拟合良好。图6为KH组合菌种的豆粕发酵大豆肽含量响应面分析图。从中可以看出,影响大豆肽含量的各因素按影响大小排依次为发酵温度>含水量>接种量,其具体表现为X2(发酵温度)曲线最陡,X3(含水量)次之,而X1(接种量)曲线变化最为缓慢。对上述回归方程取一阶偏导数等于零,得响应值最大时,其最优点(X1,X2,X3)对应的代码为(0.98348,0.47958,-0.45724),其实际值为(27.95%,35.92℃,52.71%),此时大豆肽含量的最大理论估计值为8.44%。2.7大豆肽含量测定根据优化得出的最佳试验条件,进行验证试验,重复5次,大豆肽含量平均值为8.73%;此试验值与预测值8.44%接近,因此,该模型可以较好的反映出大豆肽最佳发酵条件。3最优发酵条件下发酵豆浆含量的测定通过单因素试验以及Box-Benhnken中心组合设计响应面法,建立了KH菌种组合3个影