一测多评法测定黄柏中5种生物碱类成分

一测多评法测定黄柏中5种生物碱类成分

黄鼠尾是广州植物的黄皮树。它对加热和干燥也很有效。它具有清热除湿、清火除蒸发、解毒和艾酒疗法的作用。其主要成分有小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、药根碱等生物碱类,其中含有量最高的为小檗碱［2-4］。现代药理研究表明,盐酸小檗碱具有抗炎,降血压,降血糖和免疫调节等作用,黄柏碱与降压作用有关,而巴马汀、药根碱为抗病原微生物的有效成分［5-6］。2010年版《中国药典》以小檗碱和黄柏碱的量作为黄柏质量控制指标,尚不能全面反应黄柏的质量。目前,虽有文献报道,采用HPLC法同时测定黄柏中多种生物碱的量［7-8］,但需要多种对照品,限制了实际工作中的应用。本实验以小檗碱为参照物,得出黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀与小檗碱之间的相对校正因子(F),同时测定了黄柏中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量,建立一测多评法(QAMS)［9-17］,从而降低检测成本和时间,提高方法的实用性。1试剂和仪器Agilent1200高效液相系统,ShimadzuLC-20AT高效液相系统,FE20梅特勒-托利多pH计,SartoriusBP211D电子分析天平,KQ-300E超声仪(40kW),乙腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。木兰花碱(Must-12022901)、盐酸黄柏碱(Must-12021407)、盐酸药根碱(Must-10122001)、盐酸巴马汀(Must-11122703)和盐酸小檗碱(Must-111212110)均购自成都曼斯特生物科技有限公司,纯度为98%。黄柏样品1~3号购自广西,4~7号购自贵阳,8~9号购自湖北,10号购自湖南,11~30号购自四川荥经、青城山、都江堰、彭州、泸州等地药材市场和不同的饮片公司。经本校生药室教研室卢先明教授鉴定为黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。2标准曲线的制备2.1一测多评方法学考察2.1.1色谱条件PhenomenexLunaC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),ThermoC18(4.6mm×250mm,5μm),DiamonsilC18(2)(4.6mm×250mm,5μm)。柱温30℃,体积流量1mL/min,检测波长280nm,流动相A为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4)(45∶55)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠,调节pH至4.8),流动相B为乙腈-0.05mol/LKH2PO4(55∶45)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠,调节pH至4.5),梯度洗脱,0~12min(0B),12~18min(0~100%B),18~40min(100%B),40~42min(100%~0B),42~48min(0B)。上述色谱条件下,各组分分离度良好,色谱图见图1。2.1.2对照品溶液的制备取木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱5种生物碱,精密称定10.24、9.8、9.09、10.92、14.42mg,分别置于10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度。再稀释至适当质量浓度。精密移取稀释后的5个对照品溶液适量配为混合对照品溶液。将上述溶液保存于4℃冰箱中备用。2.1.3供试品溶液的制备取黄柏药材粉末(过4号筛)约0.5g,精密称定,置于100mL锥形瓶,精密加入盐酸-甲醇(1∶100)的混合液40mL,称定质量,超声30min,冷却后加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液补足失质量,过滤,取续滤液过0.45μm滤膜,5μL进样。2.1.4线性范围考察精密吸取上述混合对照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL,进样分析,每个质量浓度进样3次,取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理,得小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的标准曲线见表1。2.1.5校正因子计算以小檗碱为内标,计算小檗碱对木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的校正因子,见表2。2.1.6精密度试验精密吸取混合对照品溶液5μL于同一天内连续进样5次,记录木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的峰面积,得出日内精密度分别为0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明仪器较为稳定。2.1.7稳定性试验精密吸取同一供试品溶液5μL分别于配制后的0、2、4、8、12、24、48h测定峰面积,计算得木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱稳定性的RSD分别为0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供试品在48h内稳定。2.1.8重复性试验称取黄柏药材粉末(过4号筛)约0.5g共6份,精密称定,按“2.1.3”项下制备样品,测定,木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的RSD分别为1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明该方法重复性好。2.1.9加样回收率试验精密称取0.5g湖北产黄柏药材粉末(小檗碱含有量3.81%)6份,加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液40mL,称定质量,超声30min,冷却后加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液补足失质量,过滤,取滤液2mL,加1mL盐酸小檗碱(1.007mg/mL)定容到10mL,再次超声30min(重现提取过程),0.45μm滤膜过滤,进样,测定,计算,得加样回收率分别为97.1%、98.8%、96.9%、100.9%、99.0%、95.6%、RSD为1.9%。2.2校正因子的重现性考察2.2.1色谱柱及高效液相色谱仪考察取“2.1.2”项下混合对照品溶液,进样20、10、8、6、4、2μL,按“2.1.5”项下计算小檗碱对木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的校正因子。不同高效液相色谱系统和不同品牌柱子的相对校正因子见表3。2.2.2待测组分色谱峰的定位利用5个成分色谱行为的不同,以小檗碱为基准峰计算各个化合物的相对保留时间,即确定其在色谱图中的位置。结果见表4。2.3一测多评法与标准曲线法测定结果的比较按供试品溶液处理方法制备样品,分别精密吸取供试品溶液各5μL注入高效液相色谱仪测定。采用标准曲线法和一测多评法分别计算黄柏中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量,结果见表5。测定结果表明,同一样品中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量差异较大,小檗碱的量最高,部分地区不含或含少量药根碱和巴马汀。同时,不同产地黄柏生物碱量差异比较大,川产黄柏小檗碱和黄柏碱量较其他产区高,其中以四川荥经产黄柏含有量最高。3流动相和色谱柱的选择应用,导致各组分定量测定的标准曲线法和一测多评法测定质量控制实验过程中,考察了盐酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4种不同提取溶剂,采用超声提取30min,权衡5种成分提取效率,结果以盐酸-甲醇(1∶100)作为溶剂提取较为完全。同时,考察了乙腈-磷酸盐溶液作为流动相系统进行分析,其峰型较差,色谱峰重叠,改为乙腈-磷酸二氢钾(十二烷基硫酸钠,磷酸调节pH)后,峰型改善,但木兰花碱和黄柏碱色谱峰重叠,无法得到有效分离。因为将木兰花碱与黄柏碱、巴马汀与小檗碱同时有效分离需要不同浓度的有机相和不同pH。因此,考察不同pH不同乙腈浓度的混合流动相作为洗脱剂,最后实验确定以乙腈-0.05mol/LKH2PO4(45∶55)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠,调节pH至4.8)为流动相A,乙腈-0.05mol/LKH2PO4(55∶45)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠,调节pH至4.5)为流动相B,作为流动相,使各成分完全分离,且峰形较好。本实验考察了不同色谱柱、液相色谱系统对小檗碱与木兰花碱、黄柏碱、药根碱和巴马汀之间相对校正因子的影响,验证一测多评法在黄柏质量控制中的可行性和技术适应性。标准曲线法和一测多评法测定30批黄柏中生物碱的结果表明,一测多评法与标准曲线法得到的数值之间没有显著性差异,说明建立的校正因子具有较好的可信度,一测多评法能同时测定黄柏中小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、药根碱和巴马汀的量。实验中,通过对5个成分的吸收光谱并结合3D图进行分析,选择280nm作为检测波长,5个生物碱都有吸收。黄柏碱及木兰花碱与另3个生物碱母核结构不同(巴马汀、药根碱、小檗碱),UV响应值也存在不同,但一测多评法利用数学上的转换关系推算校正因子,并不关乎化学结构是否异同,故而虽然每个成分都不能实现最优的波长检测,但在一