发酵中的抑菌剂对霉菌生长抑制作用的研究

发酵中的抑菌剂对霉菌生长抑制作用的研究

黄酒的发酵是开放的。在添加的麦曲中，有许多细菌，如根霉、毛霉、糊精菌、曲霉等。生麦曲中的曲霉有米曲霉、黑曲霉、红曲霉和少量的青霉。黄酒发酵是糖化和以多品种、高密度酵母与乳酸杆菌（细菌）协同作用的混合发酵并行的过程（即边糖化与边酵母发酵、边乳酸杆菌发酵同时协同进行的三边发酵）；本文对黄酒发酵醪中的酒精、乳酸、pH值、乳酸杆菌、乳杆菌素及酵母、乳酸杆菌的代谢产物等抑制霉菌生长进行了初步研究。1耐酒精度较小的菌株据资料报道，5%（v/v）酒精度对黄曲霉生长有影响；10%（v/v）酒精度能抑制黄曲霉生长。红曲霉能耐pH2.5的酸度，耐10%（v/v）酒精度；根霉和毛霉也耐一定的酒精度，如总状毛霉有的菌株可耐7%（v/v）酒精度。经试验酒药中的根霉可以在含5.7%（v/v）酒精的麦芽汁中30℃培养24h，表面有霉菌生长。米曲霉菌接入含5%（v/v）酒精的麦芽汁中30℃培养48h，液面有米曲霉菌生长，但米曲霉菌接入含10%（v/v）酒精的麦芽汁中30℃培养，液面无米曲霉菌生长。在酒精度5%（v/v）时不能有效地抑制霉菌的生长。发酵醪都要经过约20h，酒精含量才会达到5%（v/v）左右，即在黄酒发酵初期酒精不是抑制霉菌生长的主要因素。2试验材料和方法2.1生麦曲的制备粳糯米：一等粳糯米取自公司米仓库；浆水：取自传统浸米池底部浆水，用棉塞塞住瓶口经煮沸灭菌（100℃、20min）后备用；乳酸（80%）：外购；苏16米曲霉菌种、85#酵母菌种：本实验室保存，经活化后备用；生麦曲：取自公司传统生产车间；浸后米：取自传统黄酒生产上所用的传统浸米池，放浆沥干的米。2.2主要设备培养箱，无菌室，超净工作台，灭菌锅，天平，光学显微镜，国产精密pH值试纸，1000mL三角瓶等。2.3操作要点及工艺流程制麸曲：麸曲按制曲种工艺制作，在灭菌过的麸皮上接入苏16米曲霉菌种培养，成熟后干燥而成（需无菌操作）。其工艺流程：操作要点：粳糯米加清水浸渍4h后沥干，以米:水=1:3加入清水（包括浸米吸收水分）蒸饭，蒸好饭后，在无菌室中按各试验号加料（见表1）。试验样全部加入后搅匀，移出无菌室，在培养箱内30℃培养，定时观察醪面情况。3试验结果与分析3.1试验中的细菌生长从投料起30℃分别培养4h、8h、12h、16h、24h，试验样饭醪表面霉菌生长情况见表2。3.2浆水、生麦曲、乳杆菌素对米曲霉菌生长的影响30℃培养4h～8h都无霉菌生长，因为霉菌（米曲霉菌）萌发时间需10h～12h。1﹟接入了酵母菌在30℃培养12h、16h、24h无霉菌生长，因为酵母发酵产生气泡，使醪液液化，抑制米曲霉菌生长。4﹟、5﹟加入了浆水，浆水中的乳杆菌素抑制米曲霉菌的生长。在30℃培养12h、16h、24h无霉菌生长。6﹟、7﹟、8﹟、9﹟、10﹟加入了生麦曲，生麦曲中的细菌（乳酸杆菌）和酵母快速繁殖、生长、发酵，使醪液液化，共同抑制霉菌的生长，在30℃培养12h、16h、24h无霉菌生长。11﹟、12﹟、13﹟由于加入的是传统黄酒浸后米，随饭带入的乳杆菌素抑制米曲霉菌的生长，在30℃培养12h、16h、24h也无霉菌生长。试验结果表明，乳酸杆菌和从浆水中带入的乳杆菌素能抑制米曲霉菌的生长、繁殖。而用乳酸调pH值至3.8、4.0，却无法抑制米曲霉菌的生长。3.3不同菌种生长情况从淋饭酒母加曲放水后，传统黄酒、速酿酒母、机械化黄酒投料时都加入了生麦曲和熟麦曲，其有大量的霉菌（根霉、米曲霉、毛霉、犁头霉、黑曲霉等）菌丝和孢子，随饭醪的浮起（俗称排起）而浮起，生产上观察结果如下。淋饭酒母（加曲放水后）：10h肉眼观察，品温为29℃～31℃，饭醪表面无霉菌生长，酒精度约为2.9%（v/v）。传统黄酒（缸里）：14h肉眼观察，品温为30℃～32℃，饭醪表面无霉菌生长；18h、20h肉眼观察，品温为35℃～37℃，酒精度为3.8%（v/v）左右，饭醪表面无霉菌生长。速酿酒母：7h肉眼观察，品温为28℃～29℃，饭醪表面无霉菌生长；15h肉眼观察，品温为30℃～32℃，此时酒精度为2.6%（v/v）左右，饭醪表面无霉菌生长。机械化黄酒（大罐）：7h观察品温为27℃～29℃、11h观察品温为29℃～30℃，14h观察饭醪表面都无霉菌生长；经15h品温为30℃～32℃，饭醪表面无霉菌生长，此时酒精度为4.9%（v/v）左右。经生产观察均无霉菌生长。对传统黄酒（缸里）18h后，表面饭醪和内部醪液进行显微镜下观察，曲霉、根霉等霉菌无生长。饭醪开头耙时酒精含量<5.0%（v/v），根据试验，酒精度在5.0%（v/v）左右时，曲霉、根霉等霉菌是能够生长的。因此认为黄酒发酵中耙前抑制曲霉、根霉等霉菌生长的不是酒精的作用，而是其他因素。4乳杆菌抑制黄曲霉权分散剂培养的筛选乳酸杆菌抑制霉菌的生长、繁殖的研究已有多年。徐进等用乳酸调节pH3.0～5.0并不能有效抑制黄曲霉等霉菌的生长，pH4.5的条件下霉菌孢子的活性并不受影响；更多的研究结果表明，抑制作用的产生是低pH值、乳酸菌代谢产物和微生物间相互拮抗多因素协同作用结果。试验表明，植物乳杆菌培养液和黄曲霉孢子同时接到MRS肉汤中由于黄曲霉生长受到乳杆菌的强烈抑制，故在2个植物乳杆菌处理组均未检测到黄曲霉毒素B1。植物乳杆菌ATCC8014和植物乳杆菌CCMCC1.103对4种产毒黄曲霉和产紫青霉、纠结青霉、桔青霉、皱褶青霉、短密青霉和黄暗青霉等6种青霉的孢子有抑制作用，并有较广泛的抗真菌谱。乳酸菌对霉菌生长与产毒的抑制是在霉菌孢子萌发的初期将其灭活，使孢子不能萌发形成菌丝从而不能产生毒素，在电子显微镜下可观察到寄生曲霉孢子充水肿胀而死亡，而对于快速生长期中的霉菌，乳酸菌对其生长与产毒无显著影响。对真菌孢子的灭活有种的特异性，且必须有活菌存在的条件下体现出对孢子的灭活作用。为探讨乳杆菌抑制黄曲霉孢子萌发的机制，在乳杆菌培养液、乳杆菌培养液的上清液和乳杆菌的细胞悬浮液中接种一定量的黄曲霉孢子，每隔4h分别取少量液体在PDA平板上进行霉菌计数，直到30h。28℃培养72h后计数萌发的霉菌孢子，结果表明，只有乳杆菌培养液组对黄曲霉孢子萌发有显著的抑制作用，说明乳杆菌抑制黄曲霉孢子萌发的可能机制是低pH值、乳杆菌的代谢产物与微生物间竞争多因素协同作用的结果。徐进等将植物乳杆菌与黄曲霉孢子同时加入到MRS肉汤和先厌氧培养植物乳杆菌后再加入黄曲霉孢子，以乳酸将LTB培养基的初始pH值调为3.0、4.0和5.0，以pH6.8为对照组，在LTB培养基中接种黄曲霉孢子悬液，28℃培养15d，在培养的第3d、6d、9d、12d和15d测定培养液中的pH值、黄曲霉毒素B1和黄曲霉菌丝重量。结果显示，植物乳杆菌可显著抑制黄曲霉生长，同时检测不到黄曲霉毒素B1。而无植物乳杆菌接入的LTB培养液，随着LTB培养液中pH值的降低，黄曲霉毒素B1的量增加，在pH3.0组，差异有极显著性。杨宝兰等研究植物乳杆菌ATCC8014和CGMCC1.103对桔青霉CGMCC3.2938等8株青霉孢子活性的影响。将青霉孢子接种到植物乳杆菌MRS培养液中，28℃培养24h后检测孢子的活性。结果表明，植物乳杆菌ATCC8014和CGMCC1.103对产紫青霉、纠结青霉、桔青霉、皱褶青霉、短密青霉和黄暗青霉的孢子均有灭活作用，显微镜观察植物乳杆菌ATCC8014将桔青霉CGM-CC3.2938的孢子灭活，使其不能发育成菌丝。证明了植物乳杆菌ATCC8014和CGMCC1.103对6种青霉孢子有灭活作用。黄酒发酵醪中植物乳杆菌的数量和种类是最多的菌种之一。黄酒发酵过程中的多品种、高密度乳酸杆菌抑制霉菌的生长、繁殖，使霉菌孢子不萌发。5不同菌种对酒精发酵的影响黄酒发酵醪中酒精含量5.0%（v/v）左右、一定量乳酸、pH3.8～4.0不能抑制霉菌生长、繁殖。发酵初期使霉菌孢子不萌发，并抑制霉菌生长、繁殖的主要因素是发酵醪中的乳酸杆菌和乳杆菌素。对于整个黄酒发酵过程，黄酒发酵醪中多品种、高密度的乳酸杆菌、低pH值、发酵产生和累积的乳酸（小部分从浆水中带入）、乳杆菌素（开始时有小部分从浆水中带入）和酒精等共同使霉菌孢子不萌发，抑制霉菌的生长、繁殖，阻