大蒜细胞SOD酶的提取和分离

大蒜细胞SOD酶的提取和分离大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品简介1实训目标2实训原理3实训试剂与设备4生产实训5产品检测6产品简介一、产品简介SOD是SuperOxideDismutase缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品简介SOD类型：超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种：第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品简介二、产品用途1、药物类：主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；2、生化制药：作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统；3、化妆品：可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以SOD为主要成份的化妆品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；保健食品、饮料：SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销。在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统。大蒜细胞SOD酶的提取和分离实训目标1.掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。2.掌握SOD酶提取分离的一般步骤。大蒜细胞SOD酶的提取和分离实训原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行岐化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织和细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。大蒜细胞SOD酶的提取和分离实训试剂与设备一、试剂和材料新鲜蒜瓣，0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：5），丙酮（用前预冷至-10℃）。二、实验器材研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管。大蒜细胞SOD酶的提取和分离生产实训一、生产前准备1、检查生产原料、各种生产用试剂；2、检查生产设备；3、检查生产记录等文件二、生产操作1、磷酸缓冲液制备粗酶液：将蒜瓣去外膜,于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨至蒜泥状，加入3倍体积(mL/mg)的磷酸缓冲液,浸泡30~45min后用6层纱布抽滤.将滤渣再用2倍磷酸缓冲液浸泡30min后,6层纱布抽滤.如此反复共3次，收集3次抽滤所得滤液。采用热变性法对粗酶液进行粗提：将大蒜中SOD酶液于60℃热处理20min,8500r/min离心10min,弃沉淀,取上清液。大蒜细胞SOD酶的提取和分离生产实训3、采用丙酮沉淀法进行分离纯化：将酶液置于冰浴中,加入-18℃预冷的丙酮,搅拌10min,于4500r/min离心15min，弃上清液,用50mmol/L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液,4℃过夜,4500r/min离心10min,测定上清液的SOD酶活力。

大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品检测一、检测原理邻苯三酚在酸性环境中稳定，但在弱碱性环境中会发生自氧化反应,邻苯三酚在自氧化时只接受一个电子生成超氧阴离子自由基(02+02一

),并在其自氧化过程中以一定速率产生有色中间产物,SOD可以将02一歧化分解成H2O2和02,从而抑制了邻苯三酚的自氧化速率。由此可以依据SOD分解02一的能力而间接推算SOD的活性(每分钟反应液中SOD抑制50%反应速率时即为SOD活力单位)。大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品检测二、实验试剂与器材

1、检测试剂邻苯三酚溶液:用10mmol/L的盐酸溶液配制成45mmol/L的溶液，此溶液须临用现配.Tris-HCI-EDTA缓冲液:配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液，内含lmmol/L的EDTA溶液，调pH为8.2三、检测器材试管、吸管、容量瓶、量筒、电子分析天平、比色皿、722型分光光度计。大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品检测一、检测前准备1、检测装运、各种检测用试剂2、检查检测记录等文件二、产品检测1、样品取样品10g（精确至0.001）。用水浸泡或溶解定容至I00ml过滤，取滤液备用。2、邻苯三酚自氧化速率的测定：取pH2的Tris-HCI-EDTA缓冲液4.5ml于10ml比色管中，于25℃恒温10min，再加人25℃恒温的45mmol/L的邻苯三酚溶液10µl，混匀后迅速于Icm石英比色杯325nm波长测光密度值，每隔30s测一次光密度值共测4min，求出邻苯三酚的自氧化速率ODA/min。同时用10mmol/L的盐酸做空白试验。大蒜细胞SOD酶的提取和分离产品检测2、SOD活性测定：取pH8.2