发酵技术基础-培养基及其制备

第二章培养基及其制备第二章培养基及其制备第一节微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物第二节培养基组成第三节培养基类型第四节工业培养基的选择和配制原则第五节发酵培养基的设计和优化第六节淀粉原料及预处理第七节糖蜜原料第八节石油代粮发酵第九节其他物质第一节微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物

微生物营养物质的确定主要依据微生物细胞及其代谢产物的化学组成。一、微生物细胞的化学组成细胞化学成分水（70%-90%）干物质有机物(蛋白质、多糖、脂、核酸——占干重96%

维生素、有机酸及它们的降解物）无机物（盐）

细胞含水量=（湿重-干重）/湿重×100%

一、微生物细胞的化学组成

细胞化学元素

主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫（占细胞干重97%）、钾、镁、钙、铁；微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等细胞的化学成分的作用为：遗传连续性、通透性和生化活性。注：微生物细胞的化学组成不是绝对不变的，往往与菌龄、培养条件、环境及生理特性相关。二、微生物胞外代谢产物1、代谢副产物伴随正常代谢作用所产生的一些小分子化合物，包括气体（CO2、H2、CH4）和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子质量的醇类、酮类和脂肪酸类。2、中间代谢产物在代谢途径中产生的一些小分子物质，如氨基酸、核苷酸、有机酸和单糖的衍生物，主要用于合成蛋白质，核酸、类脂和多糖等细胞物质。一般不分泌到微生物细胞外，只有在微生物细胞生物合成受阻或外源碳源浓度较高的情况下，才会大量积累和分泌于细胞外。二、微生物胞外代谢产物初级代谢：是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。这一过程的产物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸以及由这些化合物聚合而成的高分子化合物，如多糖、蛋白质、脂类和核酸等。3、次级代谢产物

次级代谢：次级代谢是指微生物生长到一定时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明显功能的物质的过程，这一过程的产物即次级代谢产物。次级代谢产物大多是一类分子结构比价复杂的含有苯环的化合物，如抗生素、激素、毒素、色素等。二、微生物胞外代谢产物4、胞外水解酶类淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖糖化酶、葡萄糖异构酶等。

次级代谢产物由微生物细胞合成，既不参与细胞的组成，又不是酶的活性基团，也不是细胞的贮存物质。次级代谢产物种类很多，通常有抗生素、激素、毒素、色素等。分泌于微生物细胞外。第二节培养基组成培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的的多种营养物质的混合物。培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢，产生人们所需产物的营养物质和原料。同时，培养基还应提供微生物生长所必需的环境条件，如一定的pH。培养基的组成和配比是否恰当对微生物的生长、产物的形成、提取工艺的选择、产品的质量和产量都有很大的影响。

工业发酵培养基碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。功能：构成菌体成分；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。水：营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物、有些需要促进剂，抗生素需要前体。一、碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分

提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃3.工业常用的碳源葡萄糖：纯葡萄糖、水解淀粉乳糖：纯乳糖、乳清粉淀粉：大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、玉米、野生植物、薯类等蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖糖蜜：糖厂的下脚醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下脚、农作物秸秆等等。糖蜜3、工业上常用的糖类①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应

工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大②糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐②淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。

例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2(半纤维素酶)(1.5g麸皮)嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型二、氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：

满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH毛霉产蛋白酶的研究初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等

有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。氮源使用的一些相关问题：

有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质

有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产

有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题三、无机盐的微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，pH对酶活的影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟四、生长因子、前体和产物促进剂、抑制剂

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136作用：前体有助于提高产量和组分用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G，需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间

用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率什么叫做流加？3、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。4、产物抑制剂

在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径活跃，以致可以改变微生物的代谢途径，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮丙酮酸乙醛α-磷酸甘油甘油2ATP2ADP葡萄糖2ADP2ATPCO2NAD+NADH+H+Pi亚硫酸氢钠乙醛亚硫酸氢钠加成物五、水

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。第三节培养基类型一、根据物理状态划分1、固体培养基(solidmedium)

天然固体基质制成的固体培养基，如马铃薯块、麸皮培养基；二是在液体培养基中添加凝固剂而制成的固体培养基。三是在营养基质上覆盖滤膜制成的滤膜培养基。用于微生物分离、鉴定、计数、测定、保藏等，生产上固体种子培养，某些产品的发酵培养基。

2、半固体培养基(semi-solidmedium)

液体培养基中加入少量的凝固剂而使之呈半固体状态的一类培养基。(0.2～0.7％琼脂)。常用于观察细菌运动特征，噬菌体效价鉴定以及厌氧菌培养等。3、液体培养基(liquidmedium)

不含任何凝固剂，其组分均匀，呈液体状态，用途广泛。常用于微生物生理代谢的各种研究，也是大规模工业发酵生产上普遍采用的培养基。

理想的凝固剂应具备以下条件：①不被微生物液化、分解和利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态；③凝固点的温度对微生物无害；④不会因高温灭菌而受到破坏；⑤透明度好、凝固力强；⑥配制方便，价格低廉。

琼脂和明胶用作凝固剂的性能比较凝固剂微生物利用程度融化温度凝固点化学本质常用量琼脂绝大多数不利用96℃40-45℃聚半乳糖硫酸酯0.5-2%明胶大多数利用（作氮源）25℃20℃动物蛋白5-12%二、按培养基营养物质的来源划分1、天然培养基(complexmedium)定义：指利用动植物、微生物或其它天然来源的难以确切知道其化学成分的原料所配成的培养基。特点：培养基化学成分复杂，营养丰富，原料来源充足，价格低廉。用途：适宜于实验室和大生产之用。举例：培养酵母和霉菌的麦芽汁培养基属于此类。

实验室常用的天然营养物质2、合成培养基(syntheticmedium)定义：采用已知化学成分的纯试剂所配成的培养基，也称组合培养基(chemicallydefinedmedium)。特点：这类培养基成分明确，重复性强。用途：适用于做分类鉴定，生物测定、选种育种等方面的研究。举例：培养放线菌的高氏一号培养基，培养真菌的查氏培养基。

3、半合成培养基(semi-syntheticmedium)定义：主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基，也称半组合培养基。即在合成培养基中加入某种天然成分而制成的培养基。特点：培养基中部分成分清楚，部分成分不清楚。用途：适合于大多数微生物的培养。大多数培养基都属此类。举例：营养琼脂（NA）中除含有天然的牛肉膏和蛋白胨外，还有成分明确的氯化钠。

三、按培养基的用途划分1、鉴别培养基(differentialmedium)

一类含有某种代谢产物指示剂的培养基。微生物在这类培养基上生长后，分泌的代谢产物与指示剂起反应产生某种明显的特征性变化，根据这种变化将该种微生物与其它微生物区分开来。

伊红-美兰培养基（EMB）：可用于鉴别大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等肠道微生物。大肠杆菌能强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带H+，染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰结合，引起菌落被染上深紫色，反射光下呈绿色金属光泽。伊红-美兰培养基（EMB）

鉴别培养基举例

2、选择培养基(selectivemedium)

根据某类微生物的特殊营养要求或对某种物理化学因子的抗性而设计出来的一类培养基。即根据被分离微生物的特性，采用“投其所好、取其所抗”的原则设计的培养基。

目的：增殖少数手段：“投其所好”混合样品

选择性培养基

成为中劣势菌

优势菌目的：抑制多数菌手段：“取其所抗”选择培养基基础培养基+嗜好营养物基础培养基+抑制剂以纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择性培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物。抑制剂：

青霉素（抑制G+细菌）分离G-细菌

抗生素氯霉素，链霉素（抑制细菌）分离酵母菌，霉菌放线菌酮（抑制酵母，霉菌）分离细菌，放线菌

结晶紫：抑制G+

分离G-

染料胆盐：抑制G+

分离G-

孟加拉红：抑制细菌、放线菌分离酵母，霉菌

其它叠氮化钠：抑制霉菌分离乳酸菌

10%酚数滴：抑制细菌，霉菌分离放线菌

用于选择性的物理因素有：温度，氧气，pH值，渗透压等

3、增殖培养基根据某种微生物的营养特性在培养基中加入有利于该微生物生长、繁殖的营养物质，以提高对该微生物的分离效率，加入这些营养物质所构成的培养基就称为增殖培养基。增殖培养基一般营养比较丰富，适合微生物生长的特点，使微生物生长快速、多产且性状典型。4、加富培养基加富培养基是指在普通培养基里加入血、血清、动物（或植物）组织提取液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。加富培养基主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。四、按培养、基用于生产的目的划分

根据培养基用于生产的目的不同，可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基等。1、孢子培养基⑴定义：孢子培养基是以菌种繁殖孢子为目的而设计的培养基，常采用固体培养基。⑵要求：既能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，又不易引起菌种变异。

创造有利于孢子形成的环境条件培养基营养不要太丰富，碳氮不宜过多，特别是有机氮源要低一些无机盐的浓度要适当，否则会影响孢子的颜色和孢子的数量注意pH和湿度

⑶生产上常用的孢子培养基包括麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米琐屑培养基以及用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和NaCl等配制的琼脂斜面培养基。2、种子培养基种子培养基是指供孢子发芽和菌体生长繁殖使用的培养基。这些营养成分应是易被菌体吸收利用的，且比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为好，以利于菌体的生长繁殖。此外，还要考虑pH。种子培养基的氮源一般采用有机氮源与无机氮源结合，有机氮源中的有些氨基酸能刺激孢子发芽，而无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长。最后一级的种子培养基，其成分要接近发酵培养基。3、发酵培养基发酵培养基是生产中供菌体生长、繁殖和合成产物而设计的培养基。发酵培养基的碳源和氮源要注意速效与迟效的搭配，尽量少用速效营养，多用迟效营养，并要注意调整适当的碳氮比，添加缓冲剂稳定pH。如果微生物生长和产物合成所需要的最佳条件不同，则可以考虑采用补料的方式来满足微生物在不同阶段的需求。发酵培养基的营养物质用量一般较大，在大规模生产时宜采用来源充足、成本低廉的原料，还应有利于下游的分离提取。第四节工业培养基的选择和配置原则

一、工业培养基的选择

选择培养基时应从微生物的营养需求与生产工艺的要求出发，使之满足微生物生长、代谢的要求，达到高产、高质、低成本的目的，其选择的一般原则如下：1、能够满足生产菌生长、代谢的需要2、目的代谢产物的产量最高3、产物得率最高4、生产菌生长及代谢迅速5、减少代谢副产物生成6、价廉并具有稳定的质量7、来源广泛且供应充足8、有利于发酵过程的溶氧与搅拌9、有利于产物的提取和纯化10、废物的综合利用强且处理容易二、培养基的配制原则1、根据微生物的营养需要配制培养基2、营养成分的恰当配比营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。C/N比：培养基所含碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。

高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。例如：发酵生产谷氨酸时：C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。

渗透压大小由溶液中所含的分子或离子的质点数决定。等重的物质，如果其分子或离子越小，则质点数越多，因而产生的渗透压越大。等渗溶液：适宜微生物生长；高渗溶液：细胞发生质壁分离；低渗溶液：细胞吸水膨胀3、渗透压4、pH

培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。通常培养条件：细菌：pH7.0~8.0;放线菌：pH7.5~8.5;酵母菌：pH3.8~6.0;霉菌：pH4.0~5.8;

为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。内源调节缓冲液：K2HPO4/KH2PO4（pH6.4~7.2）调节方式固体碳酸盐：CaCO3

外源调节：流加酸或碱调节pH值的方法还有流加碳源（降低pH）或氮源(升高pH)，也可以通过控制通气量。5、氧化还原电位

氧化还原电位又称氧化还原电势（redoxpotential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。

不同类型微生物生长对氧化还原电位(Ф)的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响

增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Ф值；培养基中加入抗坏血酸(0.1%)、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸(<0.05%)、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、庖肉等还原性物质可降低Ф值。培养基中加入氧化还原指示剂刃天青可对氧化还原电位进行间接测定

刃天青在无氧条件下呈无色；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH有关，一般在中性时呈紫色，酸性时为红色；在微含氧溶液中，呈粉红色。第五节发酵培养基的设计和优化

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。一、培养基成分选择的原则

菌种的同化能力

代谢的阻遏和诱导

合适的C、N比

pH的要求

（一）、理论转化率与实际转化率

理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标二、成分含量的确定例:

如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下∶

葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖转化为酒精的理论得率为∶

2*46

Y=───=0.57162（二）、实验设计

培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

合理的实验方法多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

三、培养基设计的步骤①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健发酵生产谷胱甘肽的培养基的优化

贺小贤，食品科技，2009原培养基:

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)

通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.005%

正交设计确定优化的配方改进后培养基原培养基改进后培养基的发酵结果四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%

补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵培养基的设计和优化发酵罐：反应器水平,

可以得出最终优化的基础配方发酵培养基的设计和优化pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究发酵培养基的设计和优化1,3-丙二醇的用途：最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二醇聚合生产聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)可作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂等用于食品、化妆品和制药等工业

例如：pH控制摇床在1,3-丙二醇发酵中的应用PTT的性能PTTPET涤纶Nylon尼龙、锦纶Acrylic亚克力Spandex(Lycra)莱卡、氨纶柔韧度++-++NA弹性+-----++丰满度++----+NA磨损++++---抗污染力++++------洗涤牢度++++------日晒牢度++-++--抗静电力++++----NA色彩密度----+++--成本---++-+--PTT最目前性能最好的纤维被誉为21世纪的大型纤维发酵培养基的设计和优化1,3-丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等发酵培养基的设计和优化伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇的代谢甘油三羟基丙醛1,3-丙二醇二羟丙酮丙酮酸乙酸乙醇乳酸丁醇丁酸丁二醇2HH2OpH下降2H发酵培养基的设计和优化不同pH条件对甘油消耗的影响摇瓶培养基分批培养过程结果发酵培养基的设计和优化补料培养过程甘油

浓度为3.43%，对甘油转化率为19%

发酵培养基的设计和优化摇瓶培养基分批培养过程结果补料培养过程结果进一步优化培养基后过程发酵培养基的设计和优化

1,3-丙二醇的浓度为6.72%，对甘油转化率为

54.7%，生产强度为1.9g/L.h。进一步优化条件后发酵培养基的设计和优化五、培养基设计时注意的一些相关问题

原料及设备的预处理

原材料的质量

发酵特性的影响

在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。

灭菌

在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提

有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。

有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3意义：很多微生物都不能直接利用淀粉(amylum)、纤维素(cellulose)、酪蛋白(casein)，因为它们不含淀粉酶和糖化酶。

发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖。

将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化（saccharification），制得的糖液叫淀粉水解糖。第六节淀粉制备葡萄糖的工艺技术

淀粉水解糖的质量对菌体的生长和产物的形成均有重要的影响。Q：如何提高淀粉的出糖率，保证水解糖的质量？

淀粉水解糖液必须达到的指标

1.糖液葡萄糖含量：90%2.糖液洁净，呈杏黄色或黄绿色

3.透光率：90%以上

4.糖液不含糊精(dextrin)5.糖液不能变质

6.转化率：90%左右转化率=

水解糖液数量（升）含糖量（%）

100%

投入淀粉量（公斤）原料淀粉中含纯淀粉%1.11一、淀粉水解糖制备的方法淀粉原料

酸解法（acidhydrolysisprocess)

水解的方法酶解法(enzymatic

hydrolysisprocess)

酸酶结合法(acid-enzymatichydrolysis)原料淀粉的性质和水解使用的催化剂(catalyst)

葡萄糖（glucose）

淀粉水解糖液麦芽糖(maltose)

复合糖类（二糖、低聚糖等）其他分解产物（氨基酸、脂肪酸等）

酸解法：以酸(无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：生产方便、设备简单、水解时间短，设备生产能力大缺点：高温高压、酸性条件、过程复杂、副反应多、损失大要求：淀粉颗粒不宜过大、大小要均匀。淀粉乳浓度也不宜过高。

酶解法：利用专一性很强的淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。

淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下完成的，故酶解法又有双酶水解法(double-enzyme)之称。优点：酶反应条件温和，不需要高温、高压和耐酸的设备；酶的作用专一性强，淀粉水解的副反应少，水解糖液纯；可在较高的淀粉乳浓度下水解；可用粗原料；糖液颜色浅，较纯净、无苦味、质量高。缺点：酶解时间长、需要专门的设备，酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。

液化（liquefaction/dextrinization):淀粉转化为糊精及低聚糖

糖化(saccharify):糊精及低聚糖进一步水解为葡萄糖

酸酶法：是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。

如玉米、小麦等谷物原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，所以液化采用酸法。淀粉G值（DE值）10-15中和糖化优点：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度。

酶酸法：是将淀粉乳先用淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖。

如碎米淀粉，若用酸水解，往往水解不均匀，出糖率低。优点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度（13Be'）较酸法（10Be'）高，生产易控制。时间短，淀粉水解副反应少。淀粉直链淀粉(amylose)：

-1，4葡萄糖苷键缩合，聚合度小。支链淀粉(amylopectin)：

-1，4键、

-1，6键，聚合度大。二、淀粉酸水解的原理

糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物的总称。具有还原性、旋光性、能溶于水，不溶于酒精，因分子大小的不同，糊精与碘可呈现不同的颜色。

淀粉

糊精（兰

暗紫

紫

红褐

暗红

红

浅红）淀粉水解过程的变化：

淀粉颗粒结构破坏，糖苷键断裂，其分子逐渐变小。先变成糊精、低聚糖、麦芽糖，最后才能生成G。

A淀粉的水解反应淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加。淀粉(amylum)糊精(dextrin)低聚糖(oligosaccharides)葡萄糖(glucose)淀粉水解的化学反应可简单表示如下：（C6H10O5)n+nH2On(C6H12O6)

理论上，淀粉转化为葡萄糖的转化率为

180.16/162.14100%=111.1%？实际转化率只有90%。

当葡萄糖值超过60时，由于G复合分解反应产生其他有味物质（龙胆二糖有苦味）及有色物质。

B淀粉的水解反应动力学(kinetics)

amylum

淀粉的水解反应watercatalyst

该反应属于单分子一级化学反应类型。(why?)

其反应速度常数K推算：一级化学反应的速度与浓度成正比关系。则-dc/dt

C

即-dc/dt=KC······(1)K---为反应速度常数

C---为表示淀粉的浓度

若用c0---水解开始的浓度,ct---t时间消耗的浓度（c0-ct）---经过t时间后，所剩下的未起反应的浓度

t---时间则(1)为：-d（c0-ct

）/dt＝K（c0-ct

）即dct/dt＝K（c0-ct

）···(2)dct/dt－－淀粉水解反应速度表示在任何时间，水解速度等于反应速度常数Ｋ与（c0-ct

）浓度的乘积。将(2)积分得（浓度从0到ct

，时间从0到t）：Ｋ＝2.303/t{lg(c0/c0-ct)}

实验测定c0

、c0-ct

、t的数值代入上式，即可求的反应速度常数。

水解反应速度常数Ｋ与下列因素有关Ｋ＝

···------催化剂的活性常数，

HCl的氢离子能100%的解离，=1；

H2SO4，=0.5~0.52；H3PO4，

=0.3；

HAC，=0.025

HCL是一种良好的催化剂。

------酸的当量浓度。Ｎ越大，则Ｋ越大，但实际酸的浓度不可能太大。水解常采用稀酸。

-------多糖的水解性常数，可衡量多糖水解的难易程度。棉花(cotten）为1；淀粉(amylum)为400；蔗糖(sucrose)为100000。

------温度对水解速度影响的常数。即在水解过程中，温度可加速淀粉水解反应的进行。例如：0.1%盐酸水解淀粉温度119°C133°C138°C143°CK值0.1250.4700.771.2C淀粉水解的副反应

葡萄糖的复合反应水解热、酸

-1，6键聚合成异麦芽糖淀粉葡萄糖糖苷键聚合

-1，6键聚合成龙胆二糖

在淀粉的酸水解过程中，葡萄糖因分解损失的量在1%，但5-羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加精制的困难。

5-羟甲基糠醛的含量高，则色素的形成量增多。反应中形成的氨基糖，也对发酵有影响。

葡萄糖的分解反应水解热、酸淀粉葡萄糖分解5-羟甲基糠醛甲酸、乙酰丙酸、有色物质。

淀粉酸水解的反应

淀粉（amylum）

酸水解

葡萄糖（glucose）

复合反应分解反应（disaccharide）复合二糖5-羟甲基糠醛(oligosaccharide)复合低聚糖有机酸、有色物质

酸水解过程中的反应：淀粉的水解反应

葡萄糖的复合分解反应

Q：如何控制水解条件，降低复合分解反应的发生？

D淀粉酸水解的工艺流程

淀粉水盐酸

调浆原料酸水解冷却中和脱色糖液过滤除杂

淀粉酸水解条件的选择

1.淀粉的质量

酸法水解的重要特点是非专一性。

表2-1酸水解对淀粉质量的要求项目指标水分11~14

总蛋白质0.3~0.5水溶性蛋白质0.01~0.02脂肪0.04~0.06粗纤维0.01`0.02

2.淀粉乳浓度的选择：

淀粉乳浓度低，DE值高，色泽浅。浓度高，复合反应易发生，色泽深。

淀粉乳浓度与水解糖液DE值之间的关系

浓度（°Bx）2624222019181716DE值89.1789.2789.9291.191.392.7792.8193.01

从表中可以看出，随着淀粉乳的浓度下降，DE值上升，表明糖液中杂质少，淀粉乳的浓度过低，则设备利用率降低。故淀粉乳的浓度在18~19°Bx(10.5~12Be')3.酸的种类和用量：

盐酸(hydrochloricacid)：催化效能为100

硫酸(sulphuricacid)：催化效能为50.35

草酸(oxalicacid):催化效能为20.45一般用盐酸，其量占干淀粉的0.6～0.7%，pH调至1.5左右。４.糖化压力和时间一般压力为２.５--２.８公斤／cm2

水解１５

--２０

注意：保持正压取样时，保证能代表釜内液体的浓度及时放料（５－１０分钟放完）５.糖化设备结构的影响

糖化锅的容积不宜过大,一般70--80m3,锅体不能太高或太矮。常采用的径高比（aspectratio）1：1.5糖化锅的附属管道也应保证进出料迅速，物料受热均匀，有利于升压，有利于消灭死角，尽量缩短辅助时间。排气蒸汽6.糖化终点的控制

从糖化曲线可以看出,DE值到达最高点后即不在上升，相反会随着糖化时间的延长而稍有下降。(why?).

糖化终点的检验：用无水乙醇检验无白色沉淀或碘液检验无色，即为终点。淀粉酸糖化的曲线

10090807060

ABC

(纯度%)152030时间(分)E水解糖液的中和、脱色除杂

1.中和：目的是降低酸度；除去蛋白质

中和剂纯碱：温和，糖液质量好，但产生的泡沫多，难控制烧碱：易造成局部过碱，使糖焦化，产生焦糖中和时注意不要反中和，边中和边测定pH值,

温度在80

C以下,一般控制60-70

C

pH值控制在4．6--5．02.脱色除杂活性炭吸附法用量：相当于干淀粉量的0.6～0.8％脱色温度:65

CpＨ值:4.6~5.0离子交换法新型磺化煤

3.过滤脱色后要进行过滤，其目的是除去中和、脱色糖化液中凝聚的蛋白质及其他不溶性杂质和加入的脱色剂，以制得澄清的糖化液。发酵工业中糖化液的过滤通常是用板框过滤机。过滤后再调节糖液的pH值至6.7-7.0。

酶法制糖工艺是以作用专一性的酶制剂作为催化剂将淀粉转化为糖的工艺。1.

－淀粉酶的水解作用

淀粉液化液

－淀粉酶能水解淀粉及其产物中的1．4-糖苷键，不能水解

-1．6-糖苷键，但能越过

-1．6-糖苷键继续水解

-1．4-糖苷键，而将

-1.6糖苷键留在在水解产物中。

直链淀粉:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。支链淀粉:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、低聚糖三、酶法制糖的理论基础及工艺

-淀粉酶的性质①热稳定性在60

C以下较为稳定，超过60

C，酶明显失活；在60

C-90

C之间，温度升高，反应速度加快，失活也加快。②作用温度最适作用温度为60

C-70

C，耐高温酶的最适作用温度90

C-110

C。③pH稳定性在pH6.0-7.0时较为稳定，pH5.0以下失活严重。最适pH为6.0。④与淀粉浓度的关系淀粉乳的浓度增加，酶活力的稳定性提高。⑤钙离子浓度对酶活力的影响

-淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离子，有的可达10个钙离子，钙离子使酶分子保持适当的构想，从而可维持其最大活性与稳定性。另外，在钙离子存在的情况下，酶活力的pH范围广。

2.淀粉酶液化条件及程度控制

淀粉的糊化与老化淀粉的糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成湖状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。淀粉的老化实际上是分子间已断裂的氢键、糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。发生糊化现象时的温度称糊化温度。不同原料的糊化温度范围不同。在酶法糖化时，－淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，因此，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。淀粉的老化程度可通过冷却时形成的凝胶体强度来表示。

淀粉液化的方法与选择

一次加酶液化法加酶的方法二次加酶液化法三次加酶液化法酶耐温性中温酶法

高温酶法高温-中温酶法原料粗细淀粉质原料直接液化法精制淀粉液化法加热的方式低压蒸汽喷射液化法常温液化法液化方法的选择淀粉液化效果：液化液均匀程度、蛋白絮凝、液化液的稳定性等液化原料的特点：蛋白含量、不溶性淀粉颗粒、老化的凝胶强度生产条件的差异：蒸汽压力及稳定性液化液的用途：一般使用耐高温的淀粉酶，采用二次加酶法，低压喷射液化。

蒸汽喷射液化工艺及条件

该工艺的特点是利用喷射器将蒸汽直接喷入淀粉乳的薄膜，在短时间内通过喷射器快速升温至要求的温度，完成糊化、液化。此法液化效果好，蛋白质等杂质凝结在一起，“不溶性淀粉颗粒”在高温下分散，从而使所得的液化液既透明又易于过滤，淀粉的出糖率也高。

二次加酶液化工艺流程

淀粉水碱液0.15%氯化钙耐高温

-淀粉酶（2/3酶）

pＨ喷射液化器5.0~7.0

95~97

C

保温液化（60分种）二次喷射（145

C，3~5分钟）二次液化罐（95~97

C）加入耐高温淀粉酶（加1/3酶，30分钟）碘液检验后结束液化。液化条件：30％－40％的淀粉乳浓度、pＨ值5—7、95

C－97

C。淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，但一般控制在5－8单位／克淀粉。

液化程度控制

在液化过程中，淀粉液化水解成较小的分子。液化程度不能太低，因为：Ａ液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作；Ｂ葡萄糖淀粉酶属于外酶，水解是由底物分子的非还原末端开始，底物分子越小，水解的机会就越小，因此会影响到糖化的速度；Ｃ液化程度低，淀粉易老化，不利于糖化，特别会使糖化液的过滤性较差。

液化程度也不能太高，因为：葡萄糖淀粉酶是先与底物分子生成络合结构，而后发生水解作用，使葡萄糖单位逐个从糖苷键中裂解出来，要求底物分子有一定的大小。液化超过一定程度，不利于糖化酶生成络合结构，影响催化效率，使糖化液的最终ＤＥ值偏低。

正常液化条件下，控制ＤＥ值在10－20之间为好。3.糖化酶的水解作用

糖化酶对底物作用从非还原末端开始将

-1.4和

-1.6糖苷键水解,也能水解麦芽糖。必须控制糖化酶的用量和底物的浓度。糖化的温度pＨ值决定于所用的糖化剂的性质。曲霉糖化酶：一般温度为60

C，pH4.0-5.0；根酶糖化酶：一般温度为55

C，pH5.0；

大生产中，根据酶的特征，尽量采用较高的温度和较低的pH值？

４.糖化工艺条件及控制

液化液灭酶（100，10分钟)－－用酸调pH值4.2-4.5，同时降温冷却60

C－－加糖化酶保温数小时－－用无水酒精检验无糊精存在时－－加热90

C－－保温30分钟--降