基于同位素稀释技术的激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法在生物样品组织切片中的应用

基于同位素稀释技术的激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法在生物样品组织切片中的应用

1基于idms的la-icp-ms定量分析方法在生物组织切片原位、微区分析中的应用激光离子提取（la-sicp-ms）是在质量分析检测的基础上结合激光提取和进样技术形成的一种新技术。1。该技术固体进样前处理相对简单,引入等离子体的干气溶胶较湿法进样干扰少,且其原位(in-situ)、微区、快速的分析优势,以及灵敏度高、检出限低、空间分辨率小于10μm、可进行多种元素含量和同位素组成测量的能力成为已成为生物医学研究中一种很有潜力的分析方法,近年来已成为质谱分析技术应用的前沿。在生物临床领域中的应用报道中,研究对象涉及植物［2～4］、动物脑［5～8］和其它生物组织切片［9～13］样品等。然而,LA-ICP-MS技术在生物临床领域的应用中,由于目前与待测样品基体相匹配的标准物质或标准样品还相当匮乏,而该技术本身受样品基体效应、分馏效应、质量歧视等是影响又十分严重,导致LA-ICP-MS在准确定量分析方面存在较大困难［14］。目前,LA-ICP-MS应用研究多集中于元素含量的相对测量,即用相对计数表示含量,不能给出绝对量值,难以满足生物医学研究中对生物组织样品原位、微区元素分布准确定量分析的要求。同位素稀释质谱法(ID-MS)是国际公认的高准确度分析方法之一,如能将灵敏、准确的同位素稀释技术与可以实现原位、微区分析的LA-ICP-MS结合,将为解决LA-ICP-MS进行生物样品原位微区准确定量元素测量提供一条理想途径。目前,基于IDMS技术LA-ICP-MS定量方法研究,主要包括两种方案:(1)固体稀释剂标记技术(Solid-spikingfordirectanalysis)。通过采用溶液稀释剂与固体样品混合、均匀化、干燥等步骤,使稀释剂与固体样品中待测元素发生同位素交换,制备出可用于标记待测固体样品的固体稀释剂,该固体稀释剂可以与待测样品混合、均匀、压片后,用于LA-ICP-MS测量的样品［15～17］。该方法由于采用了IDMS技术,使得LA-ICP-MS定量分析准确度有所提高,减小了测量不确定度,然而却不能应用于组织切片的原位、微区分析。(2)溶液稀释剂在线引入技术［18～20］。即通过溶液稀释剂在线引入到激光剥蚀样品池,在池中与剥蚀固体样品产生的气溶胶混合并发生同位素交换,混合气溶胶引入到ICP-MS中进行测量。这种方式制样过程相对简单,适用性较强,没有样品与稀释剂混合、均匀化的过程,因此可应用于组织切片样品的原位、微区定量分析。然而,此方法在应用中还存在两个技术难点:一是如何确定与待测样品发生反应的稀释剂质量;二是如何确定稀释剂与样品之间的同位素交换是否达到平衡。目前,将IDMS方法与LA-ICP-MS相结合,用于组织切片样品的原位、微区绝对定量分析尚未见报道。本研究基于同位素稀释法与LA-ICP-MS相结合的技术,开展了生物组织样品与浓缩稀释剂的同位素充分交换平衡、稀释剂添加方式、原位的同位素比测量等关键技术的探索性研究,建立了同位素稀释-LA-ICP-MS技术在生物样品组织切片中Fe元素原位定量分析方法,并采用自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片标准样品验证了方法的有效性和可靠性。在下一步的研究中,本方法将应用到小鼠脑组织切片中铁元素的二维原位微区扫描中,给出小鼠脑组织中铁元素的原位、微区定量测量及成像分布结果,这将对于脑中铁元素的分布变化与老年痴呆病的联系研究具有重要的临床意义。2实验部分2.1免疫组化流程UP213Nd:YAG激光剥蚀系统(美国NewWave公司),高分辨电感耦合等离子体质谱仪(ELEMENT2,美国Thermo公司),全自动冷冻切片机(德国SLEE公司),免疫组化笔(Liquidblockerpen,美国Sigma公司)。本实验中所用的山羊脑组织样品由英国LGC提供;用于切片的牛肝样品为SRM1577c(NIST,美国);明胶试剂(美国Sigma公司);57FeO浓缩同位素稀释剂(99.99%,国际原子能机构(IAEA)),该稀释剂样品经消解、稀释、定容后配制成0.3053μg/g,用MC-ICP-MS测定56Fe/57Fe为0.03154。10ng/g的Li,Y,Tl调谐液及玻璃标准物质SRM610(NIST,美国)用于优化LA及HR-ICP-MS的仪器条件。2.2样品制备和分析方法山羊脑组织样品:将100g山羊脑组织样品经过混合、匀浆,在!20℃下冷冻后,采用全自动冷冻切片机对脑组织进行切片,厚度为50μm。牛肝粉样品:称取适量牛肝粉末标准样品,分散在30%明胶溶液中,40℃下水浴加热,涡旋均匀化混合5min,用移液管取样30μL滴加到载玻片上,室温下干燥后形成一个模拟的组织切片样品,由载玻片在滴加样品前后分别称重的质量变化得到模拟切片的质量。样品制备过程如图1所示。待该模拟组织切片称量后,使用免疫组化笔在组织切片周围用于绘制一个边界,用移液器往边界内的组织样品上分两次滴加约0.3g的浓缩57Fe稀释剂溶液,通过这种方式,可以实现组织样品与稀释剂的同位素交换,且稀释剂不会扩散到周围载玻片上。在同位素平衡过程中采用电加热板蒸发稀释剂中的溶剂,从而控制同位素交换的时间,待溶液临近蒸干时,放置室温下自然干燥待测。分别平行制备了10片山羊脑和牛肝组织切片样品。选取其中的5片用于ID-LA-ICP-MS分析;取另外5片切片样品,将组织样品用塑料刀片刮下,收集后采用微波消解,采用同位素稀释HR-ICP-MS测量其中铁的含量,该结果将与ID-LA-ICP-MS的测量结果对照,以验证方法的可靠性和准确性。2.3idms方法检测社会中fe的同位素激光剥蚀系统采用线扫描方式,平行测定5片组织样品,每片样品扫描5条线,每条线长度约1cm,激光剥蚀系统及HR-ICP-MS测量条件如表1所示。在IDMS方法中,选取的测量同位素为56Fe和57Fe,样品测定结果的计算公式为［21］:式中,Rb,Rx和Ry分别表示混合样品(混合气溶胶)、稀释剂溶液和组织切片样品中Fe元素的56Fe/57Fe的比值;Rix和Riy分别表示Fe的每种同位素的丰度;Mi表示Fe的每种同位素的摩尔质量;Cx和Cy分别代表稀释剂和组织切片样品中Fe的浓度;mx和my分别代表稀释剂溶液和组织切片样品的称样量。3结果与讨论3.1浸泡时间对同位素平衡的影响与传统的消解-同位素稀释法不同,组织切片的原位同位素稀释法要求不能破坏样品本身,因此在稀释剂与样品的同位素交换过程中,即稀释剂溶液附着在固体组织切片上进行交换。为了实现这种交换方式条件下的同位素平衡,本工作在以下几个方面开展了研究。3.1.1验证不同状态的样品之间的同位素交换分别将5个山羊脑组织切片样品直接浸入到过量的57Fe稀释剂溶液中,分别浸泡3,6,9,15和18min,采用LA-ICP-MS测量5个组织切片56Fe/57Fe的结果,考察浸泡时间对同位素平衡的影响。由图2可见,随着浸泡时间延长,56Fe/57Fe的比值逐渐降低,这表明由于稀释剂溶液过量,组织样品与稀释剂之间可以较容易地发生同位素交换,且随着时间的延长,同位素交换过程在不断进行。将样品直接浸泡到稀释剂溶液中然后干燥是实现充分的同位素交换平衡的最理想方式,然而当样品取出晾干后,由于稀释剂溶剂的挥发,使得浸泡前后组织切片的质量几乎没有变化,也就无从得知与样品反应的稀释剂的质量。本研究采用移液器直接将稀释剂溶液滴加在组织切片上,但由于液滴会很快扩散开来,难以保证滴加的稀释剂完全停留在组织上,因此也无法确定与组织样品反应的稀释剂的量。3.1.3稀释剂的选择采用甲醇作为溶剂,其优势主要是溶剂蒸干相对容易,但甲醇易挥发的特点使得滴加稀释剂时难以保证稀释剂浓度(Cx)的稳定性,使最终的计算结果产生较大的不确定度。采用水作为溶剂,虽然溶剂蒸干过程相对较慢,但却可以保证稀释剂浓度的稳定,且在溶剂蒸干过程中可以借助电热板加温加快溶剂蒸干的速度。本研究还分别考察了用甲醇和水作为溶剂对最终计算结果的影响(图3),发现甲醇和水并无明显的偏差(t检验,p>0.05),因此后续实验中采用了水作为稀释剂。3.2原位同位素稀释剂质量在同位素稀释法的计算公式中,共需要测量3个参数:混合稀释比(Rb),样品组织的质量(my)和加入的稀释剂的质量(mx)。在传统的同位素稀释法中,由于需要将样品完全消解,my和mx可以通过称量得到。但对于组织切片样品的原位同位素稀释法,由于不能对样品进行消解处理,虽然组织切片可以通过称量载玻片在加样前后的质量得到,但是与组织样品发生反应的稀释剂的质量却难以确定。对于组织切片的原位分析,虽然将样品直接浸泡到稀释剂溶液中可以实现充分的同位素交换平衡,然而当样品取出晾干后,由于稀释剂溶剂的挥发,使得浸泡前后组织切片的质量几乎没有变化,因此无从得知与样品作用的稀释剂的质量。为了保证滴加的稀释剂溶液完全作用于样品,本实验采用组织防脱材料构建样品边界,使稀释剂完全附着在组织样品表面进行同位素交换而不会扩散,加入的稀释剂质量可由减量法获得。通过这种方式,滴加的稀释剂完全只与组织样品发生反应且不发生扩散,滴加的稀释剂的质量mx即可准确地得到。3.3idms的结果图4显示在山羊脑组织切片激光剥蚀一条扫描线上56Fe,57Fe的信号强度和56Fe/57Fe的比值结果。可以看出,56Fe和57Fe的信号不是很稳定,几乎没有平台,这是由于脑组织切片上有很多裂纹和瑕疵引起的。山羊脑组织匀浆过程中,会产生许多气泡,当冷冻切片时,气泡会导致产生一些缺陷和裂纹,从而在当激光进行剥蚀时产生不太稳定的信号。因此,如果只使用外标校准方法,切片上的裂纹和瑕疵可能造成较大的RSD(约30%~60%)。相比较而言,对于图4中的56Fe/57Fe的比值,在平台内的56Fe/57Fe的测量RSD%约为12%~18%,因此IDMS的最终结果的不确定度也小于外部校准方法。由于羊脑组织切片有很多的缺陷和裂缝,造成当激光剥蚀样品时信号起伏较大,难以达到较好的测量精度。为了克服这一不足并提高测量精度,采用牛肝粉自行制备相似基体的组织切片标准样品。牛肝粉切片在制备过程中,匀浆和分散过程可以很好的控制使其产生较少的气泡,这样制成的模拟切片样品就比较均匀,没有很多缺陷和裂痕,得到的56Fe和57Fe信号也更为稳定。图5显示,此时得到的比值信号平台中56Fe/57Fe的测量RSD约为8%~14%,很好地提高了测量精度,IDMS的计算结果也更为准确。对于山羊脑组织及牛肝组织样品,因在制备过程中经过匀浆、均匀化等过程,其中,Fe的分布是均匀的,其含量通过微波消解-同位素稀释的方法进行测量得到。因此,本工作中ID-LA-ICP-MS的方法的有效性和可靠性通过比较与微波消解-同位素稀释的方法测量结果进行验证。比较两种测量方法结果(表2)可知,虽然ID-LA-ICP-MS得到测量精度稍大,二者的结果还是一致的。4准确定量分析针对目前采用的ID-LA-ICP-MS对固体生物组织样品难以实现原位准确定量的难题,本研究将同位素稀释法与LA-ICP-MS技术结合,开展了生物组织样品与浓缩稀释剂的同位素充分交换平衡、稀释剂添加方式、原位的同位素比测量等关键技术的探索研究,通过对山羊脑组织和牛肝组织样品切片的原位定量分析的应用与比较,证明了本方法对实现生物组织样品原位准确定量分析具有可行性。在下一步的工作中,将进一步将该方法应用到小鼠脑组织切片中,开展脑组织中Fe元素的原位、微区定量分析,并开展同位素稀释剂的形态差异对生物组织中元素微区原位定量结果的影响研究。3.1.2确定滴加的同位素稀释剂与组织样品之间实现了同位素平衡严格意义上讲,不同状态之间的样品之间难以实现完全的同位素平衡,但是,经过较长时间的相互作用,样品与稀释剂已进行了充分的同位素交换。而且,稀释剂溶液中的溶剂去除后,所有的稀释剂都已附着在组织切片上,当组织样品被激光剥蚀并引