甘薯病毒病spvd的病原分离鉴定及其细胞病理学研究

甘薯病毒病spvd的病原分离鉴定及其细胞病理学研究

甘薯是我国的重要粮食，其产量和种植面积是世界上最相关的。威胁甘薯生产的病毒病害有很多种,其中甘薯病毒病(Sweetpotatovirusdisease,SPVD)是最为严重的一种,造成大规模减产甚至绝收,对甘薯生产危害很大。病害名词SPVD专用来描述感病甘薯表现出的典型症状:植株矮化,叶片变窄、扭曲、褪绿、花叶和明脉等。SPVD由两种病毒复合侵染引起,分别是长线病毒科(Closteroviridae)、毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV)和马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)。SPCSV和SPFMV复合侵染引起的SPVD比单个病毒侵染时造成的危害更大,有研究表明复合侵染下SPFMV比单独侵染时复制能力增强,病毒含量大幅提高。SPVD最早在非洲发现,现已蔓延到世界主要甘薯产区,其中在东非乌干达、坦桑尼亚等地以及南美秘鲁等地的甘薯产区爆发很严重。中国甘薯生产在2010年以前一直没有受到SPVD的危害,但现有报道称SPVD已在中国出现,并在各省份快速蔓延。SPCSV病毒粒子呈现弯曲线状,其长度短于1000nm,直径12nm;SPFMV病毒粒子也呈现弯曲线状,长度为600~900nm,直径也是12nm。二者从粒子形态上很难区分,给病原鉴定带来困难。通常SPVD的病原鉴定工作一般采用分子生物学或免疫学手段来进行,也可以用电镜直接观察病原,尽管粒子形态相似,但Crinivirus和Potyvirus感染寄主所造成的一系列细胞病理学变化有各自的特异性。Potyvirus侵染能在细胞内产生特征性的风轮状内含体;Crinivirus侵染后仅分布于寄主的韧皮部细胞内,大量病毒粒子在维管束内积累。由SPVD的两种病毒复合侵染所引起的寄主细胞病理学变化目前受关注不多。浙江以往没有SPVD侵害甘薯的报道。但2011年在杭州地区发现了疑似SPVD症状的甘薯植株,2012年该病害发生面积进一步扩大。本实验采用分子生物学手段检测确认感病甘薯的病原为SPFMV和SPCSV,并利用超薄切片电镜观察了SPFMV和SPCSV复合侵染引起甘薯植株细胞病理学变化,现将结果报告如下。1材料和方法1.1特异性引物的提取甘薯病株采自浙江杭州,症状为叶片花叶皱缩、植株明显矮化。实验使用针对Potyvirus的特异引物Sprimer、M4和M4T由浙江省农业科学院郑红英副研究员惠赠;针对SPCSV的特异引物参照文献。RNA提取用Trizol试剂和SuperScriptIIIReverseTranscriptase逆转录酶购自Invitrogen公司;ExTaqDNA聚合酶购自Takara公司;凝胶回收QIAquickGelExtraction试剂盒购自QIAGEN公司;T4DNA连接酶和pGEMT-载体购自Promega公司;其余药品试剂均为进口分析纯。1.2病毒基因组的构建选取新鲜的甘薯病叶,按照InvitrogenTrizol试剂盒的操作说明提取总RNA。以总RNA为模板使用针对Potyvirus的特异引物M4T(特异性结合基因组3’末端polyA结构)(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC(T)15-3’)进行反转录反应合成第一链cDNA。以cDNA为模板,使用针对Potyvirus属特异引物对Sprimer(5’-GGXAAYAAYAGYG-GXCAZCC-3’,X=A,G,C或T;Y=T或C;Z=A或G)和M4(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’),用ExTaq聚合酶进行PCR反应扩增获得病毒基因组的部分片段。以相同总RNA为模板,使用针对SPCSV外壳蛋白基因的RT引物SPCSV-CPRT(5’-AACGCGGAAGTGTAAGGTAT-3’)进行反转录反应,使用引物对SPCSV-CP1(5’-CGTCTAGATTGTTAGAAA-3’)和SPCSV-CP2(5’-TATATGAAAATATAGTTC-3’)用ExTaq聚合酶进行PCR反应扩增。扩增产物经凝胶回收试剂盒回收纯化后用T4DNA连接酶与pGEM-T载体进行连接,连接产物转化TG1感受态细胞,经蓝白斑反应筛选重组子重组质粒。将阳性重组质粒送测序公司进行测序,测序结果递交NCBI/DDBJ/GenBank数据库,与数据库存储数据经BLAST比对分析确定同源性。1.3染色滤纸吸干组甘薯病叶研磨,铜载网蘸取组织汁液,用2%磷钨酸(pH6.7)负染色,滤纸吸干。在HitachiH-7650型透射电镜下观察,加速电压80kV,Gatan830型CCD侧插相机记录图像。1.4原料改性聚合选取经分子鉴定为SPVD的甘薯病叶进行电镜样品制备,方法参照文献。叶片花叶区域切成2mm2见方的小块,戊二醛-四氧化锇双固定、磷酸缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水、丙酮替代、Spurr树脂包埋聚合。制备完成的树脂块样品在LeicaUC6型超薄切片机下进行超薄切片,覆膜铜载网捞片,切片经柠檬酸铅和醋酸铀双染色,置于HitachiH-7650型透射电镜下观察,加速电压80kV,Gatan830型侧插CCD相机记录图像。2对感病甘薯叶片的分子鉴定2011年在杭州浙江农科院试验田内发现带病甘薯植株,呈现植株矮化,其叶片有明显花叶症状(图1a)。与健康叶片CK相比,病叶呈现花叶褪绿,泡状皱缩扭曲,明脉等典型SPVD症状(图1b)。2012年该甘薯病害进一步加重,田间发病面积扩大。为了初步判断病毒类型,将甘薯病叶汁液经负染色透射电镜检查,观察到弯曲线状病毒粒子,无包膜,长度为600~900nm不等,直径为12nm(图1c),该病毒粒子常以束状聚集形式存在(图1d),在非提纯状态下就能达到很高的浓度。另外还观察到片层状或板状蛋白聚集体,图片放大后该聚集体呈现明显的5nm晶格样周期结构(图1e)。与负染状态下Potyvirus特征性柱状内含体结构非常相似,该蛋白聚集体可能是从完整柱状内含体脱落下来的片层结构。从该病毒粒子形态以及特征柱状内含体的出现为依据,推测病原可能是Potyvirus的成员。由于SPVD由两种形状尺寸近似的线状病毒引起,因此不排除含有两种或以上的线状病毒复合侵染的情况,需要用分子手段进一步明确病原。运用分子生物学手段对感病甘薯叶片进行病原鉴定。以Potyvirus病毒通用引物Sprimer和M4对感病甘薯叶片提取的总RNA进行RT-PCR检测,扩增出的条带经电泳检测长度约1.8kb(图2),与预期长度为1.8kb包含NIb、CP基因和3’-UTR区的片段大小相符。条带经克隆测序后,结果显示片段长度为1806bp,经BLAST比对序列分析表明,该病毒序列与NCBI/DDBJ/GenBank数据库收录的甘薯羽状斑驳病毒SPFMV核苷酸序列同源性为99%。与此同时,以引物SPCSV-CP1和SPCSV-CP2对相同甘薯叶片中提取的总RNA进行RT-PCR检测,扩增出条带为1.2kb(图2),与CP基因片段的预期大小相符。克隆测序显示片段为1182bp,经BLAST比对序列分析表明,与SPCSV核苷酸序列同源性为97%。分析认为SPFMV和SPCSV是浙江地区甘薯病毒病的病原,二者复合侵染引起SPVD。对分子鉴定确定为SPVD病症的复合侵染甘薯叶片进行超薄切片透射电镜观察,发现在叶肉细胞中存在着大量特征柱状内含体(cylindricalinclusion,CI)(图3a~3c)。从横截面观察,柱状内含体的臂为短片层状聚集体,围绕一个中心呈伸展的旋转辐射状排列,形似风轮(图3a)。从纵截面观察,柱状内含体的臂就成了长线状或长片层状,整体侧面形似柱子(图3b)。除了完整或半完整的柱状内含体外,其片层状臂结构从主体上脱落下来,散布在细胞质中,某些散落的片层状臂又能弯曲并拼合成卷筒体(图3c箭头)。在细胞质中没有观察到长片层聚集体。依据上述柱状内含体的形态结构:即出现风轮形状的柱状内含体、卷筒体和短片层聚集体可判定其为Ⅳ型柱状内含体。叶肉细胞的细胞质中还存在着大量线状病毒粒子聚集体(图3d),这些病毒粒子多以近似平行的方式成束排列,相互之间少有交错。在液泡膜处还能发现成束的病毒粒子附着于膜系统。另外,感病甘薯叶片中叶绿体出现不正常病理现象,伸出伪足状结构包裹细胞质及线粒体(图3e,3f)。在SPVD感染甘薯叶片的维管束中也观察到大量线状病毒粒子以及病毒粒子聚集体(图4a~4c),但其形状与叶肉细胞中观察到的病毒粒子不同,粒子较弯曲,排列较为杂乱,相互之间不平行(图4b)。病毒粒子分布于维管束的不同类型细胞,筛管中病毒粒子分布于管腔内(图4a),临近的伴胞中病毒粒子分布于细胞质内(图4c),也以交错的聚集体形式存在。维管束细胞中没有观察到Potyvirus特征的柱状内含体。另外,两种排列方式的病毒粒子还出现在相邻细胞中(图4e),在维管束伴胞中观察到了非平行排列的弯曲病毒粒子(图4d),而与其相邻的维管束薄壁细胞中则观察到了平行排列的束状病毒粒子(图4f),疑为复合侵染的细胞特征。3spvd细胞病理变化在浙江杭州发现的疑似SPVD症状的感病甘薯,经分子生物学鉴定其毒源为SPFMV和SPCSV复合侵染,说明浙江省甘薯栽培已受到SPVD的威胁。中国在2010年以前没有SPVD的报道,随着全球化的加快,各地联系越来越紧密,植物病害也在世界各地快速传播。目前,越来越多的SPVD在全国各地发生,本研究表明危害甘薯生产的SPVD已蔓延至浙江省,应引起农业主管部门及海关检疫等机构的重视。SPFMV和SPCSV单独侵染引起的细胞病理学变化报道较多,但复合侵染导致SPVD的细胞病理学变化还较少受人关注。Potyvirus属病毒侵染寄主植物引起的细胞病理变化主要集中在叶肉细胞,最具特征的是在细胞质中形成柱状内含体,根据结构细节不同可分为四个亚型。不同的Potyvirus病毒成员除了共有的特征柱状内含体外,其余细胞病理特征各不相同,有的还形成特殊的无定形体等。本研究在叶肉细胞中观察到线状病毒粒子聚集体、Ⅳ型柱状内含体等符合Potyvirus的特征,推测这就是SPFMV粒子。Crinivirus属病毒侵染植物引起的细胞病理变化主要是在维管束细胞内分布弯曲柔性的线状病毒粒子,某些成员会出现包含小管或纤维的囊泡状结构。本研究观察到弯曲线状病毒粒子出现于维管束细胞的筛管和伴胞中,但没有观察到包含小管或纤维的囊泡状结构,这些可能为SPCSV粒子。严格区分细胞内的病毒粒子种类还需要进一步实验获得的免疫学证据。SPVD复合侵染的样品仅在维管束和叶肉细胞交界处相邻细胞中发现了隶属于不同病毒的内含体,这种复合侵染导致的两种病毒出现在相邻细胞的现象以