微生物分类鉴定方法

第四节微生物分类鉴定的方法生物分类的传统指标分子生物学指标微型、简便、快速或自动化鉴定技术细菌的数值分类

形态学特征生理学特征生态学特征从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。生物分类的传统指标一、形态学特征培养特征、运动性、特殊的细胞结构、细胞形态及其染色特性、等等微生物分类和鉴定的重要依据之一：a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊形态结构的细菌；b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性；二、生理生化特征

与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；代谢产物等营养类型；与氧的关系；对温度的适应性；对pH的适应性；对渗透压的适应性；酶及蛋白质都是基因产物；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；二、生理生化特征

在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标分子生物学指标

DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。1.DNA的碱基组成(G+Cmol%)

分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。每个生物种都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。

GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；

G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。

若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。2.核酸的分子杂交不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。直接分析比较DNA的碱基排列顺序------由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性1）DNA-DNA杂交；（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）2）DNA-rRNA杂交；（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）3）核酸探针；（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）4）电子杂交

随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。3、其它血清学试验噬菌体分型生态特性氨基酸顺序蛋白质分析细胞壁等细胞成分通过原核生物的转化、转导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。1、API细菌数值鉴定系统2、Enterotube系统3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统微型、简便、快速或自动化鉴定技术1、API

细菌数值鉴定系统菌种基本培养基（液体）

菌悬液检测、编码、查表、鉴定适用于API鉴定细菌有700多种2、Enterotube系统不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定。3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。自动化、快速可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。每个孔中含有不同的底物菌悬液或无菌水细菌的数值分类

用数理统计的方法来处理细菌的各种特征，求出相似值，以其相似值的大小决定细菌在分类学中的关系，并把它们分为各个类群。数值分类法(numericaltaxonomy)又称聚类分类或安德生(Adanson)法。数值分类中有两个重要概念

2.运转分类单位(operationtaxonomicunit)缩写为OUT,指分类研究的个体，细菌分类中一般是指菌株。表观群(phenon):表观群指建立在表面特征相似的基础上的类群，一般是数值分类得到的类群。数值分类工作的程序

1.选择菌株和待测性状2.性状编码3.相似性计算4.进行簇群分析5.分类结果的表示选择菌株和待测性状拟测定的性状：包括形态、生理生化和生态等指标。待测菌株：包括相关已知种的模式菌株。菌株数目从几十到几百个，注意代表性。性状编码多态特征:则按相关规定将其分解为多个两态特征，或转换为二态特征。两态特征:阳性结果记录为"+"，阴性为"-"，输入计算机时阳性是"1"，阴性用"0"，资料缺失用"N"表示。将测得的性状状态记录转变成计算机能够识别运算的符号。相似性计算Ssm(匹配系数)

Ssm=(a+b)/(a+b+c+d)Sj=a/(a+b+c+d)

a：表示两个OTU性状编码皆为“1”的个数；

b：表示一个OTU为“1”，另一个OTU为“0”的性状个数；

c：表示一个OTU为“0”，另一个OTU为“1”的性状个数；

d：表示两个OTU皆为"0"的性状个数。

根据性状测定结果计算出相似的系数，它是各个OTUs之间相似程度的量值。进行簇群分析簇群分析也叫聚类分析(clusteranalysis)在考察各个OTU之间的相似性后，按相似的