基于selex技术的hiv-p24核酸适配体的筛选

基于selex技术的hiv-p24核酸适配体的筛选

p24是感染因素的中心原生动物，在病毒的包装和试验中发挥着重要作用。机体感染HIV-1后,P24在血清中出现的时间较早,一般在HIV-1感染后2～3周就可以检测,可作为艾滋病窗口期检测的血清标志物。通过检测血液中的P24,可达到早期诊断和治疗的目的。核酸适配体是通过SELEX技术筛选得到的一类寡核苷酸分子,能与靶分子强特异、高亲和力地结合,并发挥生物学效应。由于其筛选靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低,且可进行化学合成、改造与标记,核酸适配体越来越受到人们的青睐。目前,在化学分析与检测、临床诊断与治疗及药学等领域已对其开展广泛的应用基础研究。本研究利用SELEX技术筛选HIV-P24特异性核酸适配体,为建立核酸适配体辅助的P24检测方法奠定基础,对艾滋病的诊断和治疗具有重要意义。1材料和方法1.1引物、试剂和仪器HIV-P24重组蛋白(2g/L)(北京科卫临床诊断试剂有限公司);随机寡核苷酸库(2.5nmoles,84bp)5′-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC40(N)CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3′(N=A,T,C,G)、引物P9(5′-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-3′)、P12(5′-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3′)和M13-47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)(上海生物工程公司合成);NC膜(膜孔径0.45μm)(PALL公司);大肠杆菌JM-109(甘肃省医学科学研究院提供);pMD18-TVector系统(TaKaRa公司);[α-32P]dATP(北京福瑞生物工程公司);PCR所用试剂(上海生物工程公司);其他试剂均为国外或国产分析纯。1.2方法1.2.1ssna的构建1)筛选:将5μLHIV-P24(1g/L)点至圆形NC膜(半径为0.2cm)中心,待NC膜干燥后,置于0.5mL的离心管(筛选管),加入50μL封闭液(含5%脱脂奶粉、100g/L鲑鱼精DNA的PBS溶液)37℃孵育2h。同时设立不加P24的NC膜为反筛管。用含0.05%Tween-20的PBS溶液分别洗涤筛选管和反筛管3次,每次3min。用50μL10×缓冲液溶解寡核苷酸库,95℃变性5min,降至4℃。首先把变性后的库加入反筛管,37℃孵育1h。吸出反筛管中的库,加入筛选管,37℃孵育1h。筛选管和反筛管分别用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗涤3次,每次3min。然后两管中分别加入200μL洗脱缓冲液(20mmol/LTris-HCl,4mol/L异硫氰酸胍,1mmol/LDTT,pH8.3),于80℃水浴15min,立即降到4℃,吸取两管中的洗脱液,酚氯仿抽提、乙醇沉淀回收DNA,用50μL超纯水溶解待用。2)PCR鉴定回收到的DNA:从上述回收产物中取10μL为模板,配置100μLPCR体系:10×扩增缓冲液(不含MgCl2)10μL,Mg2+(25mmol/L)5μL,4种dNTP混合物(每种2.5mmol/L)8μL,引物P9(25mmol/L)1μL,引物P12(25mmol/L)1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板10μL,加超纯水至100μL。进行PCR扩增:94℃30s,55℃30s,72℃30s,共21个循环。每3个循环取样10μL,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对比筛选管和反筛管回收到的DNA的量,确定寡核苷酸对P24的富集情况。把筛选管回收到的ssDNA制备成dsDNA。3)不对称PCR制备ssDNA:从dsDNA产物中取10μL为模板,配置100μLPCR体系:10×扩增缓冲液(不含MgCl2)10μL,Mg2+(25mmol/L)5μL,4种dNTP混合物(每种2.5mmol/L)8μL,引物P9(25mmol/L)2μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板10μL,加超纯水至100μL。进行PCR扩增:94℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环。每隔5个循环取样10μL,进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,确定制备ssDNA的最佳PCR循环数,制备ssDNA。ssDNA经切胶纯化后,作为次级库,用于下一轮筛选。1.2.2s1蛋白凝胶电泳最后一轮筛选得到的寡核苷酸用[α-32P]dATP标记,在10μL10×缓冲液中与5μLHIV-P2437℃孵育1h结合,采用琼脂糖凝胶电泳(1.5%W/V琼脂糖,1×TAE缓冲体系,稳压80V)分离P24-ssDNA复合物,同时设置P24和ssDNA两个参照。放射自显影和考马斯亮蓝染色后,观察P24-ssDNA复合物的阻滞条带。1.2.3氨苄-vector法将筛选到的寡核苷酸制备成dsDNA,并切胶纯化。按照pMD18-TVector试剂盒操作,连接dsDNA到pMD18-TVector,转化大肠杆菌JM-109,菌液涂布在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上。待长出克隆后,挑取单克隆培养,采用通用引物M13-47和特异性引物P9/P12交错PCR法鉴定阳性克隆。1.2.4p-sdna与p2p4的结合将已鉴定的阳性克隆菌液利用不对称PCR制备成[α-32P]dATP标记的ssDNA。按方法1.2.1中1)所述,制备结合有P24的NC膜,同时设立空白对照。将32P-ssDNA加到制备好的NC膜上,37℃孵育2h后,用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗膜。NC膜干燥后进行放射自显影,观察32P-ssDNA与P24的结合情况。用ImageJ软件对Dot-blot结果进行吸光度分析,将与P24结合程度较好的寡核苷酸测序。1.2.5血清ntd膜按方法1.2.1中1)所述,制备分别结合有HIV-P24(2μL)、人血清白蛋白(2μL)、牛血清白蛋白(2μL)、脱脂奶粉(2μL)的NC膜。不对称PCR制备[α-32P]dATP标记的配体32P-ssDNA,Dot-blot检测配体32P-ssDNA与各种蛋白的结合情况。2结果2.1寡核苷酸对hiv-p2p4的富集作用在筛选过程中,Dot-blot鉴定第1、4、8、12轮的次级库寡核苷酸对P24的富集。ImageJ软件分析显示,反筛管相对参照值(用PBS为洗涤液的Dot-blot吸光度值)的结合百分比分别为18.9%、16.3%、15.1%和14.3%;筛选管相对参照值的结合百分比分别为21.4%、25.2%、38.4%和51.7%(图1),寡核苷酸对HIV-P24逐步得到富集。第12轮筛选时,电泳检测寡核苷酸对P24的富集效果见图2。2.2硬锁试验P24-ssDNA复合物在电泳中明显受到阻滞(图3)。2.3寡妇测定酸转化为阐明阐明鉴定结果显示,48个菌液均为阳性,目的片段有19个正向插入载体,有29个呈反向插入。2.4p-sdna与p2p4的结合程度ImageJ吸光度值分析显示,8号、15号、18号、26号和33号菌液制备的32P-ssDNA与P24结合程度较好(表1,图4)。2.5原子能试验的结果5个结合较强的候选P24核酸适配体测序结果见表2。2.6原子能适应性测定的结果特异性结合实验显示,18和26号适配体与HIV-P24有明显结合(图5),而与其他蛋白无显著结合。3研究重新确定核酸的适宜用量1990年Gold和Ellington等提出核酸适配体技术,核酸适配体以其优良的特性在医学诊断领域的基础和应用研究备受关注。研究人员利用核酸适配体可通过PCR进行扩增的特点建立了“邻近连接法”检测技术,日本学者在2009年报道了immuno-aptamerPCR技术检测VEGF。最近,基于核酸适配体的激活式分子探针用于肿瘤活细胞检测和活体成像的新方法被重点报道。这些检测方法因其具有高特异性和高灵敏度,为疾病相关标志物分析检测、病变细胞检测、肿瘤成像诊断提供了新的思路,具有广泛的临床前实验以及临床应用前景。目前,国际医学界越来越重视对P24的检测,把血液中P24的测定作为艾滋病诊断和病情监控的一个重要指标,但是临床上检测P24的主要方法仍然是ELISA,有关核酸适配体用于P24检测的研究并未见报道。如果能够将核酸适配体应用于P24检测,作为HIV核酸检测的辅助诊断方式,对艾滋病的确诊和病情监控将具有一定临床意义。本研究以P24为筛选靶,利用经典的SELEX技术经过12轮筛选,获得了针对P2