具有拮抗效果细菌的筛选与鉴定

具有拮抗效果细菌的筛选与鉴定

大豆又名豆，是属于一年生草本植物的豆类植物。在芸豆种植过程中常遇到一些病害影响芸豆的生长、产量和品质,严重者将导致芸豆绝产。芸豆病害主要有炭疽病、锈病、灰霉病、根腐病、细菌性疫病等。据美国《农业研究》报道,芸豆锈病病原菌为疣顶单胞锈菌[Uromycesappendiculatus(Pers.)Ung.],为担子菌亚门真菌属,是气传性真菌病害,一般夏秋两季发生。本病主要发生在叶片上,也危害叶柄、茎和豆荚。当前从抗病育种、化学防治和农业措施等方面做了大量工作,初见防病效果,但筛选抗病品种周期长,使用化学农药会带来环境污染和诱导植株产生抗药性。因而,开发利用新的生防菌被认为是最具发展潜力的防治方法之一。以芸豆锈病病原菌为指示菌,拟从芸豆叶际筛选到对芸豆锈病有拮抗作用的细菌,并对它们进行初步鉴定,旨在为农业生防用菌贮备菌种资源。1材料和方法1.1材料表面1.1.1srdna的pcr扩增采用通用引物27F/1495R(正向引物:5′-agagtttgatcctggtcagaacgaacgct-3′;反向引物:5′-tacgggtaccttgttacgacttcacccc-3′)进行16SrDNA的PCR扩增。芸豆健康植株,锈病植株。取样时保留芸豆根际周围直径10cm的土壤,以保持植株的生长状态。1.1.2t保蛋白凝胶DNA提取缓冲液:0.15mol/LNaCl,0.1mol/LEDTA(pH8.0);SDS缓冲液:4%SDS,0.1mol/LNaCl,100μg/mL蛋白酶K;Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(P∶C∶I):按体积比25∶24∶1配制混匀,4℃保存;氯仿∶异戊醇(C∶I):按体积比24∶1配制混匀,4℃保存;TE缓冲液:Tris·HCl,10mmol/L;ED-TA(pH8.0),1mmol/L。DNA聚合酶等分子生物学试剂购于宝生物大连有限公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.),试剂配制方法参阅文献。1.1.3培养基细菌分离用牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA),病原菌培养和拮抗菌筛选用PDA固体培养基,细菌培养用LB培养基。1.2去财产乙醇取锈病植株叶片1-2片,先用无菌水漂洗,以去除表面灰尘浮土;然后浸入75%的乙醇溶液消毒30-60s;再用无菌水漂洗数次,洗去叶面残留乙醇。待叶面水分晾干后,用消毒的解剖刀切取黄豆大小病变组织,置于PDA平板培养基上,28℃恒温培养,待真菌菌落长出,观察菌落特征及显微观察真菌孢子形态,经多次纯化,得到锈病病原菌。1.3生长双抗菌剂筛选通过梯度稀释法,从芸豆健康叶子中分离细菌,并采用传统的平板对峙方法进行拮抗试验,筛选出对芸豆锈病具拮抗能力的细菌,记录其编号,并分别转接到LB斜面上保存备用。1.4形态特征和生理生化特征的测定对拮抗细菌的菌落形态,菌体细胞形态及部分生理生化性状进行测定。1.5depch2o-pcr反应模板的制备方法参照文献。PCR反应体系(25μL):Taq酶(5U/μL)0.5μL,10×Buffer(Mg2+)2.5μL,dNTPs(10mmol/Leach)0.5μL,引物各1μL,模板1μL,DepcH2O18.5μL。PCR反应程序为95℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30个循环,72℃延伸10min;4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,溴化乙锭染色后,在UVP紫外凝胶成像系统上观察照相。目的片段用申能博彩DNA小量快速纯化试剂盒(3SSpinAgaroseGelDNApurificationkit)回收纯化,经pMD18-TVector(购自宝生物大连有限公司)连接,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆PCR验证后,送样测序,测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。1.61系统树分析信度检测测序结果用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析,采用DNAMAN6.0程序进行多序列同源性分析。使用MEGA4.0(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisSoftwareVersion4.0)程序包,构建InteriorBranchTestofPhylogeny中的Neighbor-JoiningTree,进化距离采用Jukes-Cantor算法,系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap)1000次重复检测。2结果与分析2.1细菌分离结果梯度稀释法从健康芸豆植株叶片中分离出117株细菌。通过对峙试验,共筛选出3株具有良好拮抗效果的细菌,记为SS2,L14b,NEW2。2.2菌株细胞的形态NEW2在LB平板上培养24h后呈菌落灰白色,边缘不规则突起,不透明,有粘性。菌体细胞大小为(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm。产芽孢,G+,细胞杆状。SS2在LB平板上培养24h后呈光滑,湿润,不透明,乳白色,圆形,边缘不齐,菌落较平。菌体细胞大小为(0.6-0.8)μm×(4-5)μm。产芽孢,G-,细胞杆状。L14b在LB平板上培养24h后呈菌落乳白色,边缘环状突起,中心褶皱,不透明,有黏性。菌体细胞大小为(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm。产芽孢,G+,细胞直杆状。3株菌的菌体形态如图2所示。2.3抗感菌的生理生化特性2.41系统进化树构建16SrDNA纯化产物的1%琼脂糖凝胶电泳见图3。将SS2,L14b,NEW2的16SrDNA序列提交GenBank,所得收录号分别为EU771078、EU771076和EU771079。系统进化树构建结果见图4。如图4所示,SS2与Brevibacillusbrevis同处于一个最小的分支,进化距离最接近,其16SrDNA序列与B.brevis(EU812754)的相似性达99%,将SS2鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis);L14b,NEW2与Bacillussubtilis同处于一个最小的分支,进化距离最接近,其16SrDNA序列与B.subtilis(EU257446)的相似性达100%,将L14b,NEW2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。3ss2的生理生化特性将芸豆叶际中分离得到117株细菌分离物,通过对峙芸豆锈病病原菌[Uromycesappendiculatus(Pers.Ung.)],筛选到3株细菌SS2,L14b,NEW2具有较好拮抗效果。通过对其进行形态学观察,生理生化测定,16SrDNA序列及系统发育分析,初步鉴定SS2为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis),L14b,NEW2为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。短短芽孢杆菌在生物防治领域的应用国内外均有报道,该菌的抑菌机理主要是其可以产生短杆菌肽和几丁质酶等活性物质。枯草芽孢杆菌由于其安全性和能产生多种抗菌物质的特性,已被广泛应用于农业生产中。针对从芸豆叶际筛选到的锈病拮抗菌,应用于芸豆的生物防治,在生产中应具有易定殖的优势,同时为农业生防用菌贮备了菌种资源。SS2