微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告

-!微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告一、实验目的1.学习微量凯氏定氮法的原理2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴精品文档放心下载定及其含氮量的计算等）二、实验原理凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）精品文档放心下载的含氮量。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧精品文档放心下载化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称感谢阅读为“消化”。此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提感谢阅读高溶液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化感谢阅读剂过氧化氢也能加速反应。消化过程：2NHHSO(NH)SO324424含氮有机物HSOCOSOHONH242223蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热感谢阅读-!蒸馏，即可释放出氨气。反应方程式如下：(NH

)

SO

2NaOH

Na

SO

2NHOH4 2

4

2

4

4吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收谢谢阅读完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为精品文档放心下载止（即滴定至蓝紫色)，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测感谢阅读物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。NHHBONHHBO3 3 3 4 2 3NHHBOHCLNHCLHBO感谢阅读4 2 3 4 3 3三、实验试剂、材料和器材实验材料：食用面粉。实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、精品文档放心下载指示剂、0.01MHCL。实验器材：凯氏烧瓶、电炉、凯氏定氮蒸馏装置、锥形瓶、100ml感谢阅读容量瓶、酸式滴定管。四、操作步骤1.消化（1）准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升谢谢阅读的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上；-!（2）向另一烧瓶加入1ml水作空白对照；在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀；谢谢阅读（3）将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化；精品文档放心下载（4）在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈；谢谢阅读（5）待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止；精品文档放心下载（6）消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）；谢谢阅读（7）冷却后将瓶中内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。感谢阅读2.蒸馏（1）蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3处即可。精品文档放心下载（2）取3个50ml的锥形瓶，分别加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。感谢阅读（3）加样用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗D倾入B室；谢谢阅读取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触精品文档放心下载-!硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。感谢阅读（4）蒸馏①用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸馏5分钟；感谢阅读②然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶准备滴定。谢谢阅读（5）空白蒸馏①用移液管分别吸取2ml蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。感谢阅读仪器的洗涤：3.滴定（1）蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L盐酸标准溶精品文档放心下载-!液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。谢谢阅读（2）记录所用盐酸的量。4.计算样品的总氮含量（克氮％）（AB）0.010014100C1000精品文档放心下载若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：样品的总蛋白含量（克蛋白％）（AB）0.0100146.25100C1000感谢阅读式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；精品文档放心下载14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。谢谢阅读五、实验结果序号 称量样品(g） 滴定样品用去的盐酸（ml）滴定空白用去的盐酸（ml）感谢阅读1115.20.122115.4-!滴定样品用去盐酸平均值15.215.42感谢阅读15.（3ml）样品的总氮含量（克氮％）（AB）0.020014100C1000感谢阅读0.43％若测定的样品含氮量部分只是蛋白质，则：（AB）0.0200146.25样品的总蛋白含量（克蛋白％） 100、C1000感谢阅读2.66％式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；精品文档放心下载14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。谢谢阅读六、注意事项1.本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少精品文档放心下载取样量或将样液稀释。2.勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶精品文档放心下载底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然谢谢阅读后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。3.蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着精品文档放心下载-!在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精精品文档放心下载灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。4.硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损谢谢阅读失，可置于冷水浴中。混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸感谢阅读性溶液中呈红色。七、思考题1.写出一下各步的化学反应方程式:蛋白质的消化、氨的蒸馏、氨的精品文档放心下载滴定。答：蛋白质的消化:含氮有机物HSOCOSOHONH感谢阅读2 4 2 2 2 3氨的蒸馏：NHSO2NaOHNaSO2NHOH感谢阅读424244NHOHHONH423NHHBONHHBO333423氨的滴定：NHHBOHCLNHCLHBO4234332.指出本测定方法产生误差的原因答：①在消化过程中，消化时间，催化剂，浓硫酸都要一样，一感谢阅读定要消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化谢谢阅读-!也会影响最终的浓度。②蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量一定要相同，因为不一样的蒸馏水，最后结果不一样，在蒸馏的过程中一开始要加入买的蒸馏水，蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子一定要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水一直在流动。蒸馏过程中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。加入消化液后加氢氧化钠应小心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液封。谢谢阅读③滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快容易滴定过量。滴定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大。谢谢阅读④蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不干净也会导致误差的出现。⑤本实验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应该减少取样谢谢阅读量或者样液稀释。否则会产生误差。3.消化过程中产生何种有毒气体？如何判断消化终点？答：可能会产生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化终点判定：在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶谢谢阅读颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。谢谢阅读八、讨论经过本次利用微量凯氏定氮法进行面粉中蛋白质的粗测定实验，谢谢阅读-!使我较为熟练的掌握了凯氏定氮蒸馏装置的使用，并且了解了其工作原理，这对于以后的学习是有很大帮助的。经查阅资料得，面粉中蛋白质的含量大概在9％左右，本次实验的结果为2.66％，总体来讲，本次试验较为失败，没能够粗略地测量出了面粉中蛋白质的含量。经过分析后，得出几点影响实验结果的因素，如下：谢谢阅读1.在消化过程中，消化时间，催化剂，浓硫酸都要一样，一定要消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化也会影响最终的浓度；精品文档放心下载2.蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量一定要相同，因为不一样的蒸馏水，最后结果不一样，在蒸馏的过程中一开始要加入买的蒸馏水，蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子一定要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水一直在流动。蒸馏过程中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。加入消化液后加氢氧化钠应小心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液封；精品文档放心下载3.滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快容易滴定过量。滴定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大；感谢阅读4.蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不干净也会导致误差的出现；感谢阅读5.本实验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应该减少取样量或者样液稀释。