黑曲霉固体发酵产木聚糖酶条件的优化

黑曲霉固体发酵产木聚糖酶条件的优化

木聚糖酶是一种半纤维水解酶。近年来，木聚糖酶及其解决方案在造纸、饲料和食品行业中的作用日益受到国内外的关注，并具有广阔的应用前景。由于木聚糖酶的生产成本较高,木聚糖价格又较贵,如何利用廉价的半纤维素材料高效生产木聚糖酶是研究者关注的重点。我国具有丰富的富含半纤维素类自然资源的农林废弃物,长期以来未受到充分的开发利用。如能将其用于木聚糖酶的生产,不仅可取得巨大的经济效益,还可以变废为宝,保护环境。之前的一些研究主要是以玉米芯和麸皮为主要原料进行木聚糖酶的生产,而对玉米皮的研究很少。所以本文以玉米皮为主要原料,以黑曲霉为生产菌株,对产酶的条件进行初步优化,可以为工业化生产木聚糖酶提供一些参考。1材料和方法1.1细菌和材料菌株:黑曲霉(AspergillusnigerSD-03),东北师范大学生科院微生物教研室保存;材料:玉米皮,麸皮1.2基础固体发酵培养基1.3酶活单位的确定DNS法测定。酶活力单位定义为:在酶与底物(木聚糖)反应的最适条件下,每分钟生成1umol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(IU/g)1.4酶活测定黑曲霉培养72h后向固体曲中加入100ml自来水充分搅拌,然后用3层纱布过滤,滤液离心(12000r/min,4℃)20分钟,上清液稀释20倍后用于酶活测定。2结果与分析2.1盐对产酶的影响对照组为固体基础培养基,实验组加Mandel盐(A盐10%,B盐0.1%),水、玉米皮、麸皮量不变。灭菌、接种、培养三天后测定酶活,结果如下:经过对数据分析加盐比不加盐的酶活提高近。说明加入盐对产酶有一定的影响。因此在下面的研究中加入了盐。2.2培养基浓度对黑曲霉产酶的影响配制5ml,15ml,25ml,35ml,45ml,55ml盐溶液(B盐0.1%,A盐10%)分别加入含有9g玉米皮、1g麸皮的250ml锥形瓶中,灭菌、接种、28℃培养72h后测定酶活。由图1可知当培养基含水量为25ml时,酶活力最高,当超过25ml时黑曲霉的生长受到抑制,产酶量下降。培养基灭菌、接种后分别置于25℃,29℃,32℃,37℃,42℃恒温培养72h用于测定酶活。由图2可知,当培养温度为25℃时,黑曲霉生长缓慢,产酶较低。32℃时酶活最高,29℃时与32℃时基本持平,但是在37℃、42℃时酶活下降明显,可见温度太高不利于菌体生长,并且在培养后期也会影响培养基的湿度,使产酶降低。2.3培养基初始ph值对黑曲霉产酶的影响培养基灭菌、接种后于28℃下培养,从第一个24h开始取样,每隔24h取一次,连续取10次,测定酶活。由图3可知,当菌株培养24h后酶活开始迅速上升,此时黑曲霉生长处于指数期,大量繁殖。48h~120h酶活性缓慢上升,120h~168h酶活基本持平,168h后酶活下降。故培养120h为最佳产酶时间。用适当浓度的NaOH和Hcl溶液将培养基初始PH范围调成2~10,灭菌、接种、培养后测定酶活。由图4可知,PH为2~3时,黑曲霉几乎不生长,产酶量极其低,PH在4~7范围内酶活基本持平,PH值达到8时酶活有所下降,若PH值继续升高,酶活显著下降。经测定此实验所用固体基本培养基PH约为5,故在生产过程中,为了节省时间、提高产率,选用固体基本培养基的自然PH值。2.4最适接种量为20将106个/ml的孢子悬液按0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml的接种量接种到灭好菌培养基中。28℃培养,72小时后测定酶活。由图5可知,当接种量为0.1ml、0.5m时酶活较低,当接种量达到1ml后酶活基本持平,2ml达到峰值,酶活最高。综合考虑,最适接种量为2ml。取氮源为0.1%NH4NO3,0.15%(NH4)2SO4,0.15%NH4Cl,0.25%NaNO3,0.2%蛋白胨,0.2%酵母膏,0.2%牛肉膏,0.8%黄豆粉,(以上百分数均已含氮元素量为准)分别溶于12.5ml蒸馏水中再分别加入0.025mlB盐和2.5ml无氮A盐,混匀后加入到装有9g玉米皮和1g麸皮的250ml锥形瓶中,搅拌。对照组为固态基础培养基(加2.5ml无氮A盐,0.025mlB盐)与上述实验组同时灭菌、接种、培养、测定酶活。据图6可知,无机氮源中(NH4)2SO4可大大提高酶活力,有机氮源中黄豆粉的效果最佳。生产中,为降低成本,在基本培养基中加入(NH4)2SO4。2.5正交试验结果在以上单因素实验的基础上,选取培养基含水量、培养时间、培养温度、接种量设计正交试验因素水平表(表2),以木聚糖酶酶活力为评价指标做正交试验,结果见表3。由表3可知,影响木聚糖酶产生水平的主次因素顺序为:B>A>C>D,即培养温度>培养基含水量>培养时间>接种量;得出的最优工艺组合为A2B1C2D3,即培养基含水量25ml、温度30℃、培养时间120h、接种量2ml。在此工艺条件下,木聚糖酶酶活力可达2232IU/g。3最适产酶条件及接种量通过对固体培养基不同的单因素及正交试验的研究,得到了产酶最佳条件,然后经过最佳条件的优化组合得到优化后的酶活力。经本实验研究,该菌株的最适产酶条件如下:麸皮与玉米皮的质量比为1:9,加Mandel盐,氮