二氢杨梅素微波提取工艺及其降血糖作用研究

二氢杨梅素微波提取工艺及其降血糖作用研究

藤茶（又称野生藤茶、白茶和白茶饼）是指葡萄科的蛇葡萄科的显齿葡萄。这是一种广泛分布于中国长江以南的多年生藤本植物。它是一种具有独特广告效果和用途的野生自然植物。这种植物具有完整的健康状况，具有完整的药，甜、淡、性和寒冷。具有清热解毒、抗风抗湿、肌肉骨骼强等功效。人们用自己的嫩茎制作保健茶，用于治疗感冒、喉咙疼痛、黄酮类、肝炎、伤口等疾病。已有数百年的历史。藤茶中主要有效成分为黄酮类化合物,并以二氢杨梅素的含量最高,也是目前国内外发现二氢黄酮类化合物含量最高的植物.二氢杨梅素的化学名称为3,5,7,3’,4’,5’-六羟基2,3双氢黄酮,英文名是Dihydromyricetin(缩写为DMY).二氢杨梅素是一种重要的黄酮类物质.经药理实验研究表明,二氢杨梅素具有明显拮抗高钾离子所致的兔胸主动脉条收缩反应及钙拮抗作用,且毒性低,可作为抗心律失常、心肌缺血、高血压的新型药物,能祛痰、消炎、止咳、降脂、保肝护肝,解除醇中毒;能抑制体外血小板聚集和体内血栓的形成,降低血脂和血糖水平,提高SOD活性,有望开发为国家的一、二类新药.该药材制成的袋泡剂在临床上用于高血压及冠心病辅助治疗已取得明显的效果.鉴于藤茶叶中黄酮类化合物二氢杨梅素的重要作用,研究高效提取藤茶中的二氢杨梅素的方法具有十分重要的现实意义.在本课题组研究基础上[13,14,15,16,17,18],本文采用正交实验优选方法,对微波中试规模提取藤茶中二氢杨梅素的工艺条件进行了研究和优化,提出最佳提取条件,为微波技术大规模提取二氢杨梅素提供科学依据.糖尿病是严重危害人类健康的慢性疾病,其发病率随着社会物质生活的进步和体力活动强度的减低而呈增加之势,其发病年龄也渐趋年轻化.国内外医学工作者为医治糖尿病做出了不懈的努力,积累了丰富的经验,但均只能控制而不能治愈.因此,探索根治糖尿病的有效药物和方法是当今医学的难题之一.文献报道从藤茶中分离的二氢杨梅素具有止咳、祛痰和降血糖作用.前人的研究也证明,黄酮类化合物具有广泛的生理活性[21,22,23,24,25,26,27,28,29,30].为此,本实验对二氢杨梅素的降血糖作用进行了初步的研究.1材料和方法1.1试剂与仪器实验所使用的化学试剂及仪器如下:藤茶叶:购于茶叶市场;无水三氯化铝:广州化学试剂厂;95%乙醇:天津大茂化学试剂厂;二氢杨梅素纯品:自制;四氧嘧啶:Sigma公司生产;盐酸二甲双胍:北京中慧药业有限公司;葡萄糖测定试剂盒:浙江温州东瓯生物工程有限公司;傅立叶变换红外光谱仪(TENSOR27):德国Bruker光谱仪器公司;紫外可见分光光度仪(UV-2450型):日本岛津;分光光度计(722型):上海棱光技术有限公司;微波炉(NN-K542MW型):松下电器有限公司;高速万能试样粉碎机(FW80型):天津泰斯特仪器有限公司;MAE-3微波连续提取及浓缩系统(中试规模微波萃取成套装置):上海辰灿轻工机械有限公司.1.2提取率的测定供试液通过所测出的吸光度值A,采用紫外仪标准曲线定性定量测定,代入回归方程A=8.1398X(X即为C)计算得出浓度C(mg·mL-1),根据以下公式计算:黄酮提取率(%)=1000CV·G-1×100%,V——溶剂的体积,C——浓度(mg·mL-1),G——实验样品重量(mg).二氢杨梅素提取率(%)=黄酮提取率(%)×0.89(0.89为二氢杨梅素在总黄酮中所占的质量分数,是经验数值).1.3活性炭电极纯化将粗产品溶解于沸水中,粗品与水的比例为1∶60(即1g粗品加入60mL沸水中),加适量的活性炭,电炉加热至100℃使其溶解,趁热抽滤,收集滤液.让滤液在室温下自然冷却,析出沉淀,过滤收集析出物,将析出物重复上述操作,多次结晶纯化.1.3.1测定波长的确定精密称取二氢杨梅素样品0.0102g,加95%乙醇溶解并定容至10mL,精密吸取溶液1mL分别滴入10mL的容量瓶中,精确加入5%AlCl3溶液3mL,加95%乙醇,定容至刻度,摇匀后室温放置40min,于404nm的波长下进行可见吸光度的测定.1.3.2二羟基杨梅素纯度的计算黄酮化合物纯度(%)=10×10×C/G×100%.C——浓度(mg·mL-1),G——实验样品重量(mg).1.4糖尿病大鼠血糖测定昆明种小鼠,雄性,体重23~25g,广州中医药大学实验动物中心提供.将小鼠禁食12h(不禁水)后,腹腔注射四氧嘧啶150mg·kg-1,72h后断尾取血用血糖测定试剂盒测空腹血糖,取血糖高于9mmol·L-1者作为糖尿病模型鼠.将小鼠分为正常对照组、模型组、二甲双胍(0.10g·kg-1)组、DMY高低剂量(0.12g·kg-1,0.06g·kg-1)组.喂食,2h后再取血测其血糖值.血糖测定和统计学分析:试验数据以均数±标准偏差表示,采用SPSS11软件进行统计分析.1.5mae-3微波连续提取和浓缩系统中二羟杨梅素的提取顺序图2结果与讨论2.1二羟杨梅素的提取2.1.1微波预处理和微波预处理对二氢杨树莓原汁提取率的影响采用微波预处理强化二氢杨梅素提取的方法,将在微波功率为750W和微波照射时间为4min的条件下经微波预处理后的样品,以1∶20的料液比在95℃的水浴条件下搅拌提取30min,测得二氢杨梅素的提取率达到27.53%,而未经微波预处理的样品在同样的水浴条件下搅拌提取30min后,所测得的二氢杨梅素提取率为13.73%.两者比较,微波预处理法将提取率提高了13.80%,使有效成分更易溶出.2.1.2正交实验及结果分析在小试提取基础上,本文利用微波连续提取及浓缩系统,采用正交实验方法对二氢杨梅素进行提取.实验设定的参数见表1~3.在小试实验中,提取率受到溶剂用量、微波功率和微波预处理时间及水浴浸提温度、时间因素影响,且获得了最佳工艺条件,在此基础上,在中试实验中设计了三因素二水平正交实验,如表2、表3.通过正交实验和数据处理结果可以看出,影响二氢杨梅素提取率的因素主次顺序为B>A>C,即各种因素对提取率效果影响的主次顺序依次为:料液比>微波功率>出料速度.根据以上实验结果与分析,最佳提取条件为A2B1C2,即微波功率为2800W,茶与水的料液比为1∶20,变频为40Hz.在此条件下,最高提取率可达28.87%.与小试相比,中试的提取率有所提高.2.2水加热重结晶法显齿蛇葡萄提取物中主要成分二氢杨梅素是极性化合物,在其水提物中,不可避免地含有单宁质、蛋白质、糖类、盐类以及色素等杂质,这些杂质以结合态或游离态形式与黄酮提取物共存,因此显齿蛇葡萄提取物总黄酮化合物含量为86%左右.二氢杨梅素在100℃左右热水中的溶解度约为冷水的20倍,而且采用水加热重结晶提纯法具有操作简便、安全、廉价的特点,可认为是首选方法.原料中单宁质含量高达12%,是粗黄酮提取物产生苦涩味的主要物质,经过多次重结晶,大部分的单宁质、色素留在结晶母液中被去除.重结晶过程每次重结晶次数、样品的黄酮化合物含量如表4,再按1.2进行计算得出数据.由表4可知,以水为溶剂,经5次重结晶,黄酮提取物中黄酮化合物的纯度由粗品中的52.85%升高至97.20%,黄酮化合物的纯度随重结晶次数的增加而呈线性增加,但3次重结晶后结晶纯度升高幅度变缓.且得率随重结晶次数的增加也减少,黄酮化合物在水相中的结晶为针状晶体.2.3氢难度对大鼠血糖的影响如表5所示,空腹血糖:任何两组之间空腹血糖的比较均无显著性差异,P>0.05.餐后血糖:与正常组相比,模型组餐后血糖明显升高,有极显著差异,P<0.001.与模型组相比,3组受试物组血糖均降低,有极显著差异,P<0.001.二氢杨梅素高低剂量组均有较好的降糖效果,尤其高剂量组.二氢高剂量组血糖均值稍低于低剂量组,但统计学分析两者之间无显著性差异,有待扩大样本进一步证实两者之间的剂量关系.如表6所示,糖化血红蛋白:因糖化血红蛋白反映的是抽血前1~2个月的血糖水平,本实验1~2个月时正处在造成模期,故糖化血红蛋白水平改变不明显.各组间比较,统计学上无显著性差异.血清AGES:与正常组相比,模型组血清AGES水平明显升高,有显著性差异,P<0.05.与模型组相比,DMY高、低剂量组的血清AGEX水平均之降低,有显著性差异,P<0.05.表明DMY高、低剂量组均有较好的减少积压清AGES蓄积的作用,尤其高剂量组.3重结晶法(1)通过正交试验及其结果分析,得出藤茶中二氢杨梅素的中试规模微波提取最佳提取条件:料液比为1∶20,微波功率为2800W,变频为40Hz.在此条件下提取率为28.78%.(2)以水为溶剂,采用重结晶法可有效地提高黄酮化合物的纯度,经5次重结晶,黄酮纯度由粗产品的52.85%升高到97.20%.