高效液相色谱法测定藤茶的二氢杨梅素

高效液相色谱法测定藤茶的二氢杨梅素

藤茶是青桃科蛇葡萄糖植物的结实茎和叶，主要分布在广西、湖南、福建等地。藤茶色绿起白霜,具有清热解毒、抗菌消炎、祛风除湿、强筋健骨的功效,常用于心脑血管疾病、高血压等病证的防治。藤茶中含有大量的黄酮类化合物,并以二氢杨梅素(DMY)为主。二氢杨梅素具有抗衰老、抗高血压、保肝护肝等功能。目前,测定藤茶中二氢杨梅素含量的方法很多,产地主要来自贵州、湖南、广西,我们用HPLC法对广西桂林产藤茶中的二氢杨梅素的含量进行了测定。1仪器和试剂盒1.1准对照品的测定藤茶(广西桂林干燥药材);二氢杨梅素标准对照品(中国食品药品检定研究院);甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、三氯化铁为分析纯;甲醇、磷酸为色谱纯;实验用水为超纯水。1.2实验设备和设备戴安Ultimate3000高效液相色谱分析仪(美国Dionex公司);鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ZF-2型三用紫外仪分析仪(上海市安亭电子仪器厂);预制薄层板(青岛海洋化工厂分厂)。2方法和结果2.1供试品溶液的制备取藤茶20mg,料液比1∶35,加入甲醇超声提取30min,3次,过滤浓缩,加入甲醇定容至10mL,0.45μm滤膜过滤,得供试品溶液。2.2对照溶液的制备2.3苯甲酰胺酸甲酯标准品溶液的制备吸取供试品溶液、二氢杨梅素对照品溶液10μL分别点于同一硅胶G板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%FeCl3乙醇溶液,在检测波长254nm处检视,供试品色谱在与对照品相应的位置上显相同颜色的斑点。2.4条件12.5方法研究2.5.1系统适用性测试按2.1项制备供试品溶液,按2.4项色谱条件测定峰面积,二氢杨梅素对照品溶液和藤茶供试品溶液的色谱图,见图1、图2。2.5.2对照品溶液的制备精密吸取二氢杨梅素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL至1mL瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液,按2.4项色谱条件进行测定,以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归,得线性回归方程:Y=40.333X-0.0901r=0.9998结果表明二氢杨梅素在1.31~6.55μg范围内线性关系良好。2.5.3精密度测试2.5.4进样测定精密吸取2.2项的对照品溶液,避强光放置,按2.4项色谱条件,每隔2h进样测定1次,每次进样5μL,测定二氢杨梅素的峰面积,结果表明在24h内测得的峰面积无明显变化,RSD为2.50%。2.5.5重复试验精密称取藤茶6份,按2.1项制备供试品溶液,按2.4项色谱条件测定峰面积,结果显示重复性较好,RSD为1.90%。2.5.6加样回收率试验精密称取已知二氢杨梅素含量的藤茶20mg9份,分别加入1.31mg/mL二氢杨梅素对照品1.80、2.25、2.70mL,按2.1项、2.4项色谱条件测定,计算加样回收率,结果见表1。2.6藤茶中二氢杨树氧基的含量精密称取20mg藤茶样品6份,按2.1项方法制备供试品溶液,按2.4项色谱条件进行测定,结果藤茶中二氢杨梅素的含量为29.55%。3讨论3.1氢杨树叶片的检测经DAD全波长扫描后,二氢杨梅素对照品在290nm处有最大吸收,故确定290nm作为二氢杨梅素的检测波长。实验考察甲醇∶0.05%磷酸流动相的比例(25∶75、35∶65、40∶60、55∶45、90∶10),结果显示,甲醇∶0.05%磷酸流动相的比例为35∶65时,出峰时间短,且无杂质干扰。3.2氢杨树岩样的制备实验中分别考察了提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数对样品提取率的影响,提取溶剂体积分数太低时,所提取的水溶性杂质较多;料液比增加时,二氢杨梅素提取量也在不断增加。当达到饱和时,既使继续提高料液比,所提取的二氢杨梅素不会继续增加反而下降。综合考虑节能环保等因素,最终确定供试品溶液的制备方法为:藤茶20mg,以料液比1∶35加入甲醇超声30min,重复提取3次。精密称取二氢杨梅素对照品0.0131g,置10mL瓶中,加甲醇定容,制成含二氢杨梅素1.31mg/mL的对照品溶液。色谱柱:迪马C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.05%磷酸溶液(35∶65);流速:0.8mL/min;柱温: