盐分对3种外生菌根真菌生长的影响

盐分对3种外生菌根真菌生长的影响

在30多年前，许多科学家将细菌对nacl的耐受性作为细菌分类的重要特征。近10a来,随着土壤盐渍化速度的加快,越来越多的研究向增加植物抗环境胁迫的菌根真菌转移。这些研究主要以与草本植物共生的丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhiza)为材料,发现菌根共生体能提高植物对NaCl等盐类的耐受能力,促进植物在盐渍环境下的生长,并筛选出一些对钠盐胁迫耐受性较好菌株。但是,对环境中与大量木本植物共生的外生菌根真菌却甚少研究。加拿大Alberta大学对石油开采地盐渍土壤中一些外生菌根真菌做了初步研究。本研究以中国常见的3种外生菌根真菌为材料,探讨不同外生菌根真菌对盐渍胁迫的反应,为生物改良盐渍地提供理论依据。1材料和方法1.1菌、螺钉菇和gomphidiusviscidus美味牛肝菌(Boletusedulis)、红绒盖牛肝菌(Xerocomuschrysenteron)和铆钉菇(Gomphidiusviscidus)采自北京西山针阔混交林,由北京林业大学森林病理研究室采集鉴定。1.2固体培养基的制备改良Kottke营养液加入15g·L-1琼脂,在1.4×105Pa下高温灭菌20min,冷却至50℃注入灭菌培养皿,制备成固体培养基。分别接种供试菌种,在24.5℃下培养1周,备用。1.3土壤中微量元素的提取供试土壤为山东东营黄河三角洲地区的盐碱土,称取200g土样于400mL烧杯中,加160mL去离子水,用力搅拌,静置24h后抽滤,得土壤提取液。该提取液含钾8.8mg·L-1,钠13.6mg·L-1,氯44.6mg·L-1,全磷0.08mg·L-1,总氮2.6mg·L-1。将土壤提取液置于5℃冰箱中,备用。1.4含钠和土壤浸出液的培养基的制备将NaCl加入到含15g·L-1琼脂的Kottke营养液中,制成浓度分别为0.05、0.10和0.20mol·L-1pH6.95的NaCl固体培养基;将葡萄糖(10g·L-1)和琼脂(15g·L-1)先后加入盐渍土壤提取液中,制成pH6.95的土壤提取液固体培养基。2种培养基经1.4×105Pa高温灭菌10min,取20mL倾入直径为10cm的无菌培养皿内,冷却后待用。将面积为5mm×5mm的菌块从母菌培养基中取出,接种于上述含钠盐和土壤浸出液培养基中,置于24.5℃恒温箱内培养。每个菌种均设5个重复,以Kottke固体培养基为对照。1.5保菌剂的制备菌斑直径:自接种第2天起,每天1次定时测定固体培养基上3菌种菌落的直径,按垂直方向测量2次,取平均数。菌丝干重:将生长菌丝的固体培养基放入200mL去离子水后在电炉上加热溶解,定性滤纸过滤,再用60℃去离子水冲洗菌丝;将菌丝体连同滤纸一起置于80℃烘箱内烘干24h,然后置于干燥器内风干48h,分析天平称重。钠元素含量:将称重后的菌丝置于20mL钢套Teflon溶样器中,滴加5mL分析纯HNO3溶液,封闭,于180℃烘箱中加热6h。冷却后,在电热板上蒸发至无白色烟雾出现,再将菌丝消化液用高纯水定容到50mL。用原子吸收分光光度计(Z-5000)测定菌丝消化液中钠元素含量。1.6处理数据用MicrosoftExcel和Origin6.1进行方差分析和生长模式拟合。2结果与讨论2.1培养基中细菌生长情况不同浓度钠盐和盐渍土壤提取液固体培养基上菌落直径测定结果的非线性拟合见图1。从图1可以看出,3株菌种菌落直径增长均为指数增长模式,但不同菌种表现出不同的生长特性。红绒盖牛肝菌、美味牛肝菌和铆钉菇菌种均在接种第2天就开始生长,且直接进入直线增长期,增长斜率分别为0.30,0.43和0.86。铆钉菇菌种增长斜率最大,第6天直径达到8.34cm,进入缓慢生长期,第8天达9.5cm,充满整个培养皿。红绒盖牛肝菌直径增长速度最为缓慢,第7天直径达4.36cm后进入缓慢生长期,第12天收获时菌落直径仅6.16cm。3菌种菌丝生长方式明显不同,美味牛肝菌菌丝主要为垂直方向生长,红绒盖牛肝菌菌丝渗入培养基中,铆钉菇菌丝却主要在培养基表面伸张展开。钠盐和土壤提取液处理没有改变菌斑直径增长模式,在3种浓度钠盐和土壤浸出液处理下3菌种的增长模式依然为典型指数增长模型(表1)。从图1可以看出,与对照比较,各种钠盐浓度对菌落生长速度影响存在显著差异。美味牛肝菌菌落菌斑直径随培养基钠盐浓度的提高而递增,在土壤提取液中钠盐浓度为0.232mol·L-1时,菌斑直径生长达到最大,为9.34cm,而在对照条件下,其直径增长速度最为缓慢,在第12天生长结束时菌斑直径仅为7.52cm,为土壤提取液条件下的80%。在土壤提取液条件下,红绒盖牛肝菌菌落直径增长速度最快,显著大于对照以及各浓度钠盐处理,在第12天收获时菌落直径达到7.1cm,高出对照15.3%,而在NaCl盐处理下,菌落菌斑直径增长明显受到抑制。随着钠盐浓度的增加,菌斑直径增长速度明显降低,培养基中钠盐浓度为0.20mol·L-1时直径增长呈现最低生长趋势,在收获时直径仅为5.2cm,为对照的84.4%。与美味牛肝菌和红绒盖牛肝菌不同,低浓度钠盐促进了铆钉菇菌斑直径的增长,而高浓度钠盐却有明显的抑制作用。在土壤提取液中铆钉菇菌丝直径增长差异不显著,进入缓慢生长期时菌斑直径只有对照的94.7%。菌丝在土壤中迅速蔓延的菌种,显示其对新环境有较强的适应能力。供试3株外生菌根真菌中,铆钉菇增长率最高,蔓延速度最快,说明其对新环境适应快,有可能成为改良盐渍土的优良菌种。2.2不同盐分对3种外生菌根真菌生长的影响不同浓度钠盐以及盐渍土壤提取液处理对3菌种菌斑直径和干重都有极显著影响(P<0.01)。在不同浓度钠盐处理下,菌丝生长特性差异较大。美味牛肝菌在3种浓度下生物量都有所增加,以0.10mol·L-1钠盐处理时生物量最大,为0.0556g,是对照的1.38倍。与此相反,红绒盖牛肝菌和铆钉菇菌丝生长明显受抑制,菌丝生物量随盐浓度的增加而递减,在0.20mol·L-1钠盐条件下生物量最小,分别比对照减少了24.7%和56.2%(图2)。在东营盐渍土壤提取液条件下,3菌种的生物量都明显受到抑制,美味牛肝菌、红绒盖牛肝菌和铆钉菇生物量分别比对照降低了71.4%、42.7%和86.2%。铆钉菇生物量最小,为0.0059g,是美味牛肝菌、红绒盖牛肝菌的51.3%和45.4%。本试验表明各浓度钠盐对3种外生菌根真菌的生长都有不同程度的影响,红绒盖牛肝菌和铆钉菇明显受到抑制,而且盐浓度越大,抑制作用越明显。这与许多学者的研究结果相似。Nagarajan等对Pisolithustinctorius的研究表明,钠盐浓度超过0.06mol·L-1时,菌丝生物量随钠盐浓度的增加而降低,促进菌丝生长的最佳钠盐浓度分别为NaCl0.0619mol·L-1,Na2SO40.0644mol·L-1。Blomberg等指出,在0.05～0.20mol·L-1浓度范围内,NaCl抑制植物和菌丝酶的活动。但是,在本试验中,美味牛肝菌对高浓度钠盐表现出很强的适应能力。过量钠盐反而促进了菌丝生长,其中0.10mol·L-1钠盐的促进作用最明显,0.20mol·L-1处理下生物量积累也比对照大。Hutchison的研究表明在10mg·mL-1(相当于0.171mol·L-1)NaCl处理下,美味牛肝菌菌丝生长受到严重抑制。该菌种可因生长发育环境不同而形成不同特性的生态型菌株。因此,菌种对钠盐的生长反应,除环境条件的影响外,也可能是菌种内遗传差异的表现。2.3培养基中钠元素积累的趋势不同浓度钠盐和盐渍土壤提取液对3菌种菌丝中钠元素含量的影响见图3。由图3可以看出,美味牛肝菌、红绒盖牛肝菌和铆钉菇对钠元素吸收的能力依次增强,在每单位重量中,红绒盖牛肝菌和铆钉菇钠元素吸收量分别高出美味牛肝菌52.7%和69.1%。3菌种菌丝中钠元素含量随培养基中钠元素浓度的升高而升高,但不同菌种菌丝钠积累速度和增长方式不同。对菌丝钠积累量和培养基钠浓度进行拟合,相关方程显示,红绒盖牛肝菌和铆钉菇菌丝中钠积累与培养基中钠浓度呈指数相关(表2),但钠元素积累方式差异很大。红绒盖牛肝菌在较低钠浓度下,菌丝中钠积累量相对较低,而在较高钠浓度下,钠积累有显著增加的趋势。铆钉菇菌丝钠积累随钠浓度的升高虽也呈指数增加,但增加率随培养基中钠浓度升高而降低,最后有达到饱和的趋势(图4)。美味牛肝菌菌丝中钠的积累量随培养基钠浓度的增加而直线增加,当培养基中钠浓度为0.20mol·L-1时,菌丝钠积累量达到最大值(1.2484mg·g-1),为对照的1.93倍。表明美味牛肝菌菌株对钠盐的耐受能力比较强。菌种对环境胁迫的抗性,不仅体现在菌丝生物量的积累上,也反映在菌丝对过量元素的吸收和积累能力上。菌根真菌侵染植物后,大量钠元素滞留在菌丝中,可能提高植物对钠盐胁迫的抗性,减轻对植物的危害。在本试验中,菌丝钠元素积累量随钠盐浓度的增加而增高,显示菌丝对钠元素具有较强的吸收和积累能力。不同菌种对钠元素的吸收和积累方式存在显著差异(图4),说明不同菌种对钠元素的积累机理可能不同。过量钠在菌丝细胞内的代谢机理有待进一步研究。与实验室单纯过量NaCl处理相比,盐渍土壤提取液对菌丝生长和Na元素积累有更大的影响。东营盐渍土壤提取液NaCl浓度为0.232mol·L-1,在此浓度下,各菌种菌丝的生长均受到极显著的抑制作用。而通过Na元素积累模型计算,同样浓度下美味牛肝菌、红绒盖牛肝菌和铆钉菇菌丝对Na元素的积累分别为盐渍土壤提取液中各菌丝的45.85%、93.10%和63.96%。Kernaghan等发现,Laccariabicolor能耐受高浓度的钠盐胁迫,但是对盐渍土壤提取液的耐受性却很差。同样Na浓度的盐渍土提取液比Na处理营养液对菌丝生长的抑制作用要强得多,可能是盐渍土壤理化性质的多样性和多种元素协同作用的结果。供试盐渍土除含大量NaCl外,还含有CaCl2、CaSO4等钙盐,这些盐类可能对植物和菌种的生长产生协同作用。有研究指出,Cl离