荷瘤小鼠证候及其演变的研究

荷瘤小鼠证候及其演变的研究

辨证论治是几千年来中医药管理经验和理论的高度概括。“同时疾病和不同的疾病”和“同时疾病和不同的疾病”的治疗效果在现代临床上得到了反复证实。病证结合基础研究主要采用实验动物,对于如何判断实验动物的证候,尤其是疾病动物的证候,以及评价其疗效,以往主要采取三种方式:①以方测证;②微观辨证(即引用临床或实验发现的与证候有关的实验室检测指标);③疾病、证候叠加造模。在取得积极进展的同时,其局限性妨碍了其推广与应用。长期以来,我们和国内许多学者一再观察到,疾病大鼠、小鼠存在证候和证候的演变,正常大鼠、小鼠存在体质差异。因此,我们提出基于“四诊”的小鼠辨证论治假说[1~2],并开展了多年的探索[3~16],创建了实验小鼠四诊与辨证方法学,以及小鼠四诊采集项目、小鼠四诊工作站及操作、小鼠常见证候辨证等系列标准[17~19]。最近,我们采用以上方法,在肿瘤的中药复方疗效评价中成功地运用,并有所发现。1材料和方法1.1实验动物中心KM品系小鼠120只,雄性,体重17~24g,购自上海复旦大学医学院实验动物中心,合格证号:KM,SCXK(沪)2002-0002。清洁级条件下常规饲养,腹水传代肝癌H22细胞右腋下接种0.2ml(含瘤细胞数8×106个)。1.2中药复方组模拟组接种后第5d选出瘤体大小适中的小鼠90只(其余淘汰),随机分为10组:正常对照组(甲)、模型对照组(乙)及8个不同中药复方组,每组10只。中药复方来自国内公开报道的处方,分别标记为丙、丁、戊、己、庚、辛、壬、癸,并于当天用药。中药采用标准水煎醇沉工艺,剂量为正常成人每公斤体重的10倍。每组小鼠每日灌胃0.5ml,正常组及模型组灌等量自来水。常规饲养。1.3abb/gca的计算标准采集体重、腋温(℃)、爪和尾显微数码拍照(计算机图像处理,提取反映红色程度的r值)、晚间35s旷场自主活动计数(跨格数的水平移动、前肢离地数的垂直移动)、瘤体积(cm3,计算公式:abb/2,a代表肿瘤的长径,b代表肿瘤的短径)、估算瘤重(g,瘤重=瘤体积)、生存时间。具体设备与方法参照有关标准[17~19]。1.4扩大组见表1基于实测值的嘴唇r校正①腋温校正=初次正常组腋温均数/本次正常组腋温均数×各样本实测值;②爪r校正=初次正常组爪r均数/本次正常组爪r均数×各样本实测值;③尾r校正=初次正常组尾r均数/本次正常组尾r均数×各样本实测值。1.5体重、浓度及生化指标①痰瘀邪盛=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均数。>1.5为邪毒甚,>2为邪毒壅盛;<0.75为邪较弱,<0.5为邪弱。②阴虚程度=各小鼠正常或去瘤体重/正常组体重均值。<0.9为阴偏虚,<0.8为阴虚。③气虚程度=各小鼠水平移动数/正常均数×0.6+各小鼠垂直移动数/正常均数×0.4。>1.5为气盛,<0.5为气虚。④阳热程度=各小鼠校正腋温/正常组均数×0.3+各小鼠爪校正r/正常组爪r均数×0.5+各小鼠尾校正r/正常组尾r均数×0.2。>1.02为阳偏盛,<0.98阳偏虚,<0.95阳虚。(5)阳气虚程度=气虚程度×0.2+阳虚程度×0.8。>1.1为阳气盛,<0.85为阳气虚。1.6统计方法2结果2.1小鼠自主活动减少①总体上,荷瘤小鼠肿瘤体积呈持续增长;去瘤体重呈抛物线状,中晚期增长平缓(图1,图2)。②荷瘤小鼠好奇和自主活动持续下降,旷场检测小鼠水平和垂直运动减少(图3)。③荷瘤小鼠腋温持续下降,下降幅度大,严重时降幅达9%(图4)。④荷瘤小鼠爪、尾颜色变淡,反映红色程度的r值下降。其中爪r的变化显著,严重时降幅达9.2%(图5)。⑤荷瘤小鼠带瘤生存时间如图6,图中所见,代号为壬、辛、癸等的中药复方疗效较好。2.2不同阶段的红足虱综合征2.2.1增长迅速者早期偏多肿瘤增长的快慢标志着邪毒的盛衰。荷瘤小鼠肿瘤增长迅速者早期偏多,以后逐渐减少;肿瘤增长缓慢者所占比例逐渐增加,可能与存活时间较长的小鼠肿瘤细胞增生不活跃和体质较好有关(图7)。2.2.2中期、晚期、期期7d与人类类似,随着病情的发展,荷瘤小鼠虚证出现的频率增加(为简捷明了,合并阴虚含阴偏虚、阳虚含阳偏虚、阳气虚含阳气偏虚);从不同虚证的程度看,气虚的程度最严重,其次是阳气虚。阳虚恒定,但幅度小,阴虚则不一致,推测与实验后期所存活动物体质相对较好有关(图8、9)。研究发现:①接种后的第7d,证候以邪毒为主,虚证无证可辨接近半数,虚证以单证居多。②接种后的第14d,总体进入中期,邪毒已不是重点,肿瘤体积居中的增加,并保持下去。阴虚和偏阴虚占16%,明显增加;气虚比例也显著上升;阳偏虚、阳虚的比例大幅上升,并均保持下去。对于阳虚如此高发,以往未见报道,可能是小鼠的特点。该阶段死亡以阳气虚为主要原因,因此,扶持阳气十分必要。此时阴虚多为气阴两虚、阴阳两虚,仅1例为单纯阴虚。③第18d,邪毒大多不甚;阳虚比例下降,可能与剩余动物体质较好有关;该阶段,单纯阴虚出现3例,有所增加。④第21d,该阶段小鼠出现大量死亡,集中在阳气虚、阴阳两虚。由于阳虚普遍发生,已无单纯的阴虚。⑤第25d,已进入晚期,该阶段小鼠出现大量死亡,集中在阳气虚、阴阳两虚。⑥第28d,该阶段小鼠出现大量死亡,集中在阳气虚。提示,晚期保护阳气的重要性。⑦第32d,阳虚减少,而阳气虚增加,提示气虚程度的严重。2.2.3趋势和凭证组合与人类类似,随着病情的发展,荷瘤小鼠虚证兼证的比例增加。趋势是无证可辨的数量和比例下降,单证的数量和比例下降;两证组合变化不大;而3个兼证组合者显著增加,四证组合从无到有,有增加趋势(图10)。2.3般性格状态第1次不同组别小鼠的证候改变是不是标准偏差所造成的?同样标准下,正常小鼠证候表现如何?历次检测后辨证结果见表1。从表1可见:①小鼠1号,早期出现2次气盛/阳偏盛/阳气盛,中间出现1次气虚/阳气虚,以后均正常。小鼠3号,早期出现1次偏阴虚,中间出现1次阳偏虚,其余正常。这2只小鼠可能存在性格波动,或兴奋,或压抑。②小鼠4、8号,前3~4轮一致出现气盛/阳盛/阳气盛,以后正常。可能属于那种早期兴奋,以后失去新鲜感者。小鼠5、7、9号,中间出现1~2次气盛/阳盛/阳气盛,其余正常。可能属于那种偶尔兴奋一次的。小鼠2、6、10号,中间出现1次气虚/阳偏虚/阳气虚,其余正常。这8只小鼠可能存在一定的体质差异,尤其是4、8号小鼠,体质偏热。③最后两次检查各小鼠均在正常范围,提示随着饲养延长,小鼠逐渐适应,体质和性格趋同。以上结果与荷瘤小鼠证候持续发展形成了鲜明的反差,表明本实验四诊和证候数据是客观的,是可以真实反映证候及其演变的。2.4痰瘀邪盛证候与预后的关系是否能在荷瘤小鼠出瘤的早期,依据其证候或体质,判断其预后?我们求出同一日死亡小鼠不同证候的权重平均值,与生存天数比较。其中痰瘀邪盛程度与预后的相关系数为-0.539,P=0.01,具有统计意义,提示荷瘤小鼠早期肿瘤增长迅速者,预后差(图11)。阴虚程度与预后的相关系数为-0.316,P=0.15,提示早期阴盛(主要由瘤重叠加所致)预后不佳(图12)。气虚程度与预后的相关系数为0.275,P=0.21,提示早期气虚程度严重者,预后较差(图13)。阳虚程度与预后的相关系数为0.236,P=0.29,提示早期阳虚程度严重者,预后较差(图14)。阳气虚程度与预后的相关系数为0.287,P=0.19,提示早期阳气虚程度严重者,预后较差(图15)。从以上结果可见:①早期肿瘤增长迅速,体积大,邪毒壅盛者,预后不良。这是决定预后的主要原因。②早期气盛略优于气虚,阳气盛略优于阳气虚。此外,我们还观察到:实验中,腋温下降、体重持平和下降是预后差的重要标志。一旦腋温或体重下降,多濒临死亡。与阳气衰竭、阴虚液脱类似。总之,痰瘀邪盛证候与预后的关系最为密切,痰瘀邪盛证候越重,其生存期越短。其次与预后有关的证候依照密切程度为阳气虚、气虚、阳虚。2.5病料中的制剂的选择依据荷瘤小鼠虚证复杂和严重程度,以及生存天数,总体上癸、己、庚、辛等4张处方疗效较好,而丙、丁、戊、壬4张处方疗效较差。这些疗效较好的处方主要包括清热解毒、健脾益气、养阴、行气破血活血和化痰等治法;药物涉及半枝莲、白花蛇舌草、铁树叶、石见穿、生山栀,生地黄、山萸肉、炙鳖甲,党参、黄芪、白术、甘草、淮山药、红枣,炒白芍、当归、三棱、莪术、五灵脂、牡丹皮、鸡内金,炒枳实、香附、木香、升麻、柴胡,半夏、陈皮、茯苓、生薏苡等。那么以上疗效的取得,单纯取决于处方,还是由于分组偏倚,尤其是那些早期邪毒壅盛证候的小鼠分配到那些疗效不好的组别中所造成的?我们把疗效较差的丙、丁、戊、壬4张处方组别合并,把疗效较好的癸、己、庚、辛等4张处方组别合并,与模型和正常对照。结果如下。2.5.1组不同偏倚造成疗效差异的原因如图16所示,疗效较差的4个组别,早期肿瘤邪毒壅盛,因而其疗效差异的主要原因可能是分组偏倚所造成的。鉴于第一次检查是在用药后第2天,所以其差异可能还与不同处方疗效有一定的联系。2.5.2气孔虚早期不同组别的阴虚、气虚、阳虚、阳气虚程度类似,以后逐渐有了差别。这种差别可能是肿瘤自然发生的,也可能受到了药物影响(图17~20)。3结论3.1不同日期检测结果腋温、爪尾显微照片虽然采用标准检测和拍摄,但由于受到设备、环境等因素的影响,不同日期检测得到的数据,在所有组别出现了一致的波动,或偏高或偏低。为了前后比较,一律采用初次正常组均数校正。3.2职业性状的证候分析①中医学通常把肿瘤病机归结为痰瘀毒。邪毒盛则增长迅速,因此依据肿瘤体积大小,划分为邪毒壅盛(为所有肿瘤体积均数的2倍)、邪毒甚(1.5倍)、居中,邪较弱(0.75倍)和邪弱(0.5倍),反映邪气盛衰。②阴虚主要表现为形质减少,例如消瘦、脉细、剥苔等,一旦兼见气虚、阳虚,热象往往不显著。鉴于此,我们把正常或去瘤体重/正常组体重均值,<0.9计为阴偏虚,<0.8计为阴虚。③气虚的重要标志是乏力,突出表现为运动减少。小鼠旷场移动是很好的检测方法。在旷场中,小鼠表现为水平移动,以及直立两种主要运动方式。相比之下,水平移动区域广,差别大。因此我们取各小鼠水平移动格数/正常移动均数×0.6+各小鼠抬头起立数/正常均数×0.4,与正常组均数相比,>1.5计为气盛,<0.5计为气虚。④阳热盛衰的重要标志包括体温和体表颜色,阳热盛往往表现为体表温度高、面红目赤。从小鼠爪、尾标准摄像中,可以提取反映红色程度的r值,r值愈高表示爪愈红。鉴于小鼠腋温波动较大,以及爪反映红色的程度和灵敏度优于尾,我们采用各样本校正腋温/正常均数×0.3+各样本爪校正r/正常爪r均数×0.5+各样本尾校正r/正常尾r均数×0.2的运算公式,求出各小鼠的阳热指数,并依据数据分布,初步设定为>1.02为阳偏盛,<0.98阳偏虚,<0.95阳虚。⑤阳气集中代表了气和阳的综合特征。鉴于小鼠旷场移动频率波动较大,我们采用气虚程度×0.2+阳虚程度×0.8来综合反映阳气盛衰程度,与正常组均数相比,>1.1为阳气盛,<0.85为阳气虚。以上证候阈值的确定,是参照临床特点和实测数据分析后作出的。至于如何验证和获得最佳阈值,需要大量的实验验证。但是,作为统一的标准,这样的阈值对所有小鼠是一致的,因而是可以比较的。3.3不同节点的治疗①荷瘤小鼠气虚的程度最严重。②荷瘤小鼠腋温逐渐下降,类似的爪、尾红色程度一致下降,表明荷瘤小鼠具有典型的阳虚证候,并成为该病的主要证候之一。③肿瘤邪毒证候贯穿始终。其程度早期差异大,肿瘤增长或快或慢,以后逐渐趋同,增长缓慢的个体比例逐渐增加,这可能与存活时间长的小鼠肿瘤细胞的不活跃和体质较好有关。因此,早、中、晚不同节点的治法应有所区别。④荷瘤小鼠的兼证和证候演变与人类类似,随着病情的发展,兼证的比例增加;趋势是无证可辨、单证数量和比例下降,复合证显著增加。⑤通过对正常小鼠证候观察,表明正常小鼠存在一定的体质差异,而历次检测,所获得数据基本是稳定的,集中在正常范围之内,提示我们所建立的工作站和方法、标准是可行的,也是可以真实反映证候及其演变的。3.4荷兰瘤鼠的预后3.5诊检测指标的发展是前提①在小鼠证候采集中,首次采用了标准化的四诊检测技术,所有指标实现了计量化、标准化、客观化;小鼠证候的严重程度实现了量化描述;该方法的建立有助于疗效评价。②所有小鼠的辨证采用了统一的标准,计算机计量辨证,避免了人工辨证带来的误差。③客观揭示了荷瘤小鼠与人类类似,证候及其兼证会逐渐增加,日渐严重,因此可以很好地模拟临床肿瘤证候的演变,用于病证结合研究。④采用疾病模型,通过非创伤性的四诊手段,观察疾病状态下证候的自然发生及其演变,从而可以避免以方测证、微观辨证、病证叠加造模等方法的局限,为中医药病证结合和辨证论治的基础研究提供了方法学,具有重要的学术意义和应用价值。本研究存在的问题在于所选择的四诊检测指标还很有限。鉴于中医临证的特点是通过望闻问切采集四诊指标,方便、实用、经济、有效,鉴于此,我们依据文献和我们的经验,业已建立了系列标准[17~19],但付诸大样本的检测,工作量大,检测质量难以控制。因此,如何进一步探索和发展小鼠四诊检测指标,重在实用和有效,是我们今后努力的方向。采用SPSS11.5统计软件进行相关分析。(1)总体上,荷瘤小鼠预后与早期肿瘤增长速率(邪毒盛衰)密切相关,早、中期肿瘤增长迅速者,生存期往往较短。由此得到的启迪是:①不同治法的疗效比较与评价,要求荷瘤小鼠接种出瘤后,依据肿瘤出瘤先后、大小分层随机分组,避免分组偏倚,影响疗效判断;②早期控制肿瘤的迅速增长十分必要。(2)总体看,荷瘤预后与气和