第六章 化学毒物的一般毒性作用-急性毒性

第六章外源化学物的一般毒性作用毒性作用？一般毒性作用：也称基础毒性作用，指外源性化学物在一定的剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对机体（实验动物和人类）产生综合毒效应的能力。可分为急性毒性、重复剂量毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。特殊毒性作用：包括致突变、致癌、致畸，简称为“三致”。第一节急性毒性作用一、概念和试验目的1．概念急性毒性（acutetoxicity）是指机体（实验动物或人）一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期（最长到14天）所引起的机体的毒性效应（包括一般行为、外观改变、大体形态变化等），以及死亡效应。实际工作中，机体接触化学毒物的方式或途径不同，急性接触的含义也有所不同。一次接触是指瞬间给实验动物染毒，如经口染毒、经注射途径染毒。经呼吸道与经皮肤染毒而言，则是指在一个特定的期间使实验动物持续地接触化学物的过程。当化学物毒性很低，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多次”，一般不超过三次。急性接触的时间和次数中毒效应出现的时间急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。有的化学毒物在实验动物接触几分钟内即可产生严重中毒症状，甚至瞬间死亡；而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中毒症状和死亡，呈现迟发毒效应。有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学物早期仅有较轻微症状，几天后又出现严重中毒症状甚至死亡。在实际工作中，大部分毒物的急性毒性症状在短期内出现，一般为7~14天。2．急性毒性试验的目的测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，LD50为最主要的参数，并根据LD50值进行急性毒性分级。其他毒性参数还有LD100、LD01、LD0等。通过观察动物中毒表现，毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）和对人类的潜在危险性程度。为重复剂量、亚慢性和慢性毒性研究及其他毒性试验提供接触剂量的设计依据，并为观察指标的选择提出建议。为毒理学机制研究提供初步线索。

3．有关急性毒性试验常见的参数急性毒性上限参数，以死亡为终点：半数致死剂量或浓度（LD50或LC50）；绝对致死剂量或浓度（LD100或LC100）；最小致死剂量或浓度（MLD，LD01或MLC，LC01）；最大耐受剂量或浓度（MTD，LD0或MTC），或称为最大非致死剂量（MNLD）。急性毒性下限参数，以非致死性急性毒作用为终点：观察到有害作用的最低水平（急性毒性LOAEL）；未观察到有害作用的水平（急性毒性NOAEL）。因此，急性毒性试验可以分为两类。一类是以死亡为终点，以检测受试物急性毒性上限指标为目的的试验，这类试验主要是求得受试物的LD50值。另一类急性毒性试验检测非致死性指标。二、实验动物选择1．选择原则一般原则：毒性反应与人相近；操作方便，易饲养和管理；品系纯，价格低，易获取；选择两种（啮齿类，非啮齿类）以上动物分别求其急性毒作用参数。其他条件选择：年龄：刚成年的健康动物；性别：雌、雄各半；雌、雄分笼喂养；分组：随机分组；检疫期：1~2周，如是猫、狗，则须检查肠道寄生虫或直接驱虫治疗。2．选择方法种属的选择：脊椎动物的大小、生命周期、生育行为都较为适宜，有些已被训化，有利于被培育成标准动物。最主要的急性实验动物是大鼠，几乎占全世界所报导的研究外源化学物急性毒性试验的一半，占第二位的是小鼠。

为什么要选大、小鼠呢？

因为它的毒性反应与人较为一致，而且繁殖快、易饲养、价格便宜且易获取。使用实验动物来推论于人必须慎而慎之。因为动物的反应敏感性一般不及人。曾有报导发现有138种化合物人对之反应比大鼠更为敏感。人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值

化合物种类化合物数目敏感比值*无机化合物404.2±0.66有机磷化合物161.9±0.46有机氯化合物201.8±0.30药物6210.5±5.80*以大鼠为1，人：大鼠另外，由于不同种属动物其生理状况不一，在做实验时要根据实验需要注意：啮齿类动物：无呕吐反应猫、狗：呕吐反射灵敏，可用于研究引发呕吐的实验。兔、豚鼠：多用于经皮肤接触的毒作用研究。猴：用于一些特殊的实验。年龄和体重的选择动物种类寿命(年)成年体重选择范围时间(月)体重(克)急性试验慢性试验小鼠1.5~221518~2515~18大鼠2.0~2.53150180~24050~100豚鼠6~82250200~250150~200家兔4~93~415002000~25001200~1500猫10~123~410001500~25001000~1500小狗---1500~25001200~2000狗15~203~48000~150004000~6000急、慢性实验动物年龄、体重选择动物分组的均衡性和随机性均衡性：要求每组动物的平均体重和体重的离散度尽可能一致，具体来说：每组实验动物之间的平均体重相差不应超过10％——控制均衡性；每组实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20％——控制离散度；随机性：每只动物分散到各组中去的机会是均等的，以避免成见和系统误差。实验分组与动物数量在利用不同的方法测定化学物LD50时，实验设计中对动物数量的要求不同。一般要求雌雄兼用，每个剂量组每种性别至少5只动物，至少设置3个不同的剂量组（一般为5-7个剂量组）。霍恩氏法测定LD50要求有4个剂量组，每组4-5只动物。概率单位法测定LD50要求5-7个剂量组，每组10只或以上动物。在对不同的化学物测定时，也应根据其相应的试验规程确定实验动物数量。实验动物的预检适应性饲养1-3周左右，选择健康的动物。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周犬、猴可适当延长至2-3周设定检疫期的目的：让实验动物在本实验室条件下适应一段时间，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响；筛检健康状况等不符合试验要求的动物。1）初设剂量组以了解的LD50值为中间剂量组的剂量，按一定的比值，再向上或下各推1-2个剂量组，开始时，组距要稍大些。例如：某受试物相关文献查阅结果，其大鼠经口LD50约为40mg/kg，可按此剂量倍数差４，对数剂量差0.6（lg4=0.6）为组距，划分上下各两组。3.剂量分组与设计组别剂量(mg/kg)对数剂量1.2.51.6021-2×0.62.10.01.6021-0.63.40.01.60214.1601.6021+0.65.6401.6021+2×0.6某化合物预实验剂量表如果估计受试物致死剂量范围较窄，也可将组距缩小，例如以剂量倍数1.6，对数剂量差0.2（lg1.6=0.2）为组距，此时上表的范围缩小。某化学物预实验剂量表组别剂量(mg/kg)对数剂量1.15.6251.6021-2×0.22.251.6021-0.23.40.01.60214.641.6021+0.25.102.41.6021+2×0.22）按预实验求得大概剂量范围后（即10%-90%或0-100%）再按下式求正式试验的组距。i=或i=

（n=组数）3）各实验组剂量=最低剂量组的对数值+i，然后再反对数求得。4）一般测定LD50，设为5-7组。过多→浪费；过少→不准确。各组动物数相等：小鼠每组不少于10；大鼠6-8；兔4-6；各组实验动物雌雄各半，必要时还要分别求雌雄动物的LD50；急性毒性试验中，当高剂量达到5g/kg时，实验动物仍无明显毒性，或虽有毒性体征但无死亡，此时一般可不再求LD50。三、受试物及处理受试物的接受、分样、保管、秤重、配制以及在此过程中严格的质量保证影响急性毒性实验的结果。受试物剂型：水溶液、混悬液、油溶液。给药容积的大小，根据染毒途径和实验动物物种来确定。各种染毒途径的最大容积，以受试动物的物种或剂量确定，一般规定染毒的最大容积为：①经口：20ml/kg（对空腹动物）；②经皮：2ml/kg；（根据体表面积计算）；③静脉注射：1ml/kg（5分钟以上）；④肌肉注射：0.5ml/kg（一个部位）；⑤吸入：2mg/L；⑥眼：每眼0.01ml；⑦鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml；⑧直肠：0.5ml/kg；⑨阴道：大鼠0.2ml，兔1ml。四、经典急性毒性试验方法

＊经胃肠道＊经呼吸道＊经皮肤＊其它途径：注射1．经胃肠道途径用于观察：能否经胃肠道吸收及吸收情况吸收速度致死剂量染毒方式：１）灌胃２）喂饲３）吞咽胶囊经口染毒的重要注意事项：“禁食”经口接触，动物应事先禁食，以防止胃内容对化合物毒性的影响。禁食期间正常给予饮水，染毒2小时后提供饲料。大、小鼠主要在夜间进食，故应隔夜禁食，如预计第二天上午给药，则在凌晨开始就应禁食。家兔、狗等在上午喂食前给予受试物，即可达到空腹的目的。例如大鼠食入NaCl：禁食时LD50为3.75g/kg；不禁食时LD50为6.14g/kg。１）灌胃

优点：直接入胃，不与口腔、食管粘膜接触而致吸收；剂量准确；如空腹给予，尚能消除胃内容的影响；缺点：工作量大；长期、多次应用易致食道粘膜损伤。方法等体积给药：即单位体重所给予的药物（重量或体积mg/kg；ml/kg）应一致。因为成年动物的胃容量与体重之间有相关，按单位体重计算灌胃液的体积可使受试物吸收速度相对稳定。一次灌胃体积小鼠：0.2-1ml/只(0.1-0.5ml/10g)大鼠：<5ml/只(0.5-1ml/100g)（也有要求<3ml/只）家兔：<10ml/2kg狗：<50ml/10kg２）喂饲优点：符合人类接触毒物的实际情况。缺点：受试物如有异味，动物拒食，也存在口腔粘膜吸收的可能性；受试物如有挥发性，可使剂量下降，并存在呼吸道吸入等交叉吸收；受试物如易水解或与饲料中某些成分发生反应，易影响毒效应；为准确掌握每个动物的实际摄入量则需分笼喂养，还需折算实际摄入量，比较繁琐。一般急性毒性试验不用喂饲法。３）吞咽胶囊

优点：剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解、有异味的化合物；兔、猫、狗等大动物常用此法。缺点：不适用于大鼠、小鼠。2．经呼吸道途径研究外来化合物经呼吸道接触的目的：能否造成呼吸道损伤能否经呼吸道吸收及其中毒特点吸收速度致死剂量（即LD50）经呼吸道接触外来化合物的方式有二：吸入呼吸道注入1）吸入接触优点：与实际情况较相符；缺点：吸入成分复杂。（1）静式吸入优点：设备简单、操作方便、消耗动物少。目前仍较常用。缺点：接触环境密闭；O2分压下降，CO2分压升高，温度升高，湿度升高；受试物浓度逐渐降低（皮毛、桶壁等的吸附）；存在交叉接触（胃肠道、呼吸道、皮肤）；接触时间、放置动物数和染毒柜容积均有一定限制。实验动物最低需气量及不同体积染毒柜放置的动物数

动物种属呼吸通气量(L/h)最低需气量(L/h)不同容积染毒柜放置动物数*25L50L100L300L小鼠1.453.453~56~1012~1536~40大鼠10.0830.511~25~6

注：*按吸入2小时计为防止出现缺氧与二氧化碳滞留现象，要求在接触期内染毒柜的O2分压不能低于19%，CO2分压不能超过1.7%。较大动物一般不使用静式染毒吸入方法，若使用则染毒柜的容积要相应增大。如家兔每小时最低需气量为250L，猴为300L，可依此推算染毒柜的体积。

（2）动式吸入指动物置于有空气流动的染毒柜中，此装置具有动力部分，能使新鲜空气不断进入，污浊空气不断排出，有不断补充受试物的配气部分。从而使染毒柜内的受试物浓度比较稳定，氧分压恒定、二氧化碳分压恒定，这样可以使得接触时间不受限制。动式吸入装置如图动式接触有二种形式：动式吸入接触：有皮肤接触面罩吸入接触：无皮肤接触动式接触的优、缺点：优点：染毒时间可不受限，染毒浓度相对稳定；缺点：消耗受试物多，设备复杂。2）气管内注入在实验动物麻醉的情况下，将已消毒灭菌的受试物（粉尘旋液或液体）注入气管，使之分布于左右肺内。这种方式多用于制造急性中毒模型，而不常用于急性毒性试验。3．经皮肤接触研究外源化学物经皮肤接触的目的：能否经皮肤吸收及其毒性特征能否引起皮肤损伤吸收速度致死剂量皮肤是多层结构，外来化合物只有穿透角质层达到真皮才能吸收入血。因此研究经皮肤吸收是指对完整皮肤而言。经皮肤吸收有四种结局：①不穿透、不损伤；或少量吸收，但很快降解，无中毒反应出现。②经皮肤吸收导致中毒，最终死亡。③局部刺激或损伤，不伴有全身中毒。④皮肤过敏、光敏反应。1）经皮肤吸收研究动物选择：皮肤解剖、生理特征与人相近的豚鼠、家兔或小型猪。①定性试验浸尾试验：一般大鼠尾部浸两小时兔耳法：观察双侧兔耳变化②定量试验在试验动物脱毛部位定量涂布受试化合物，以求出经皮接触的剂量-反应关系。脱毛方法：化学法：脱毛剂硫化钡＋滑石粉１:４硫化钠＋淀粉１:４机械法：剪剃去毛脱毛部位：兔、豚鼠背部中线两侧大鼠尾部、背部中央或腹部脱毛面积：体表面积的10-15%体表面积=10.4W0.667(W指体重)脱毛后必须观察24小时，确认无皮肤损伤后才能进行实验。实验方法：可用玻璃钟罩法，接触受试物2-6小时，接触剂量以mg/kg或mg/cm2表示。2）局部皮肤作用研究局部作用研究可以结合皮肤吸收试验一起观察，也可以单独进行。①局部作用研究与经皮吸收实验共同进行：取下玻璃钟罩后，观察局部中毒反应。经皮吸收毒性试验所用剂量大，有时尚未取下玻璃钟罩，动物可能已经死亡，因此不一定能观察到完整的局部损伤的变化。

②单独设计局部作用研究斑帖法在脱毛区（1cm2），帖敷浸有受试物的多层纱布，剂量小于致死剂量，再盖上油纸或塑料布，贴牢并固定，12-24小时解开，观察皮肤反应。皮肤反应评分很淡的红斑(几乎观察不到)1边界清晰的红斑(淡红→鲜红)2中等严重的红斑(鲜红→深红)3有红斑及轻微焦痂出现4皮肤反应评分很轻微的水肿(几乎观察不到)1轻度水肿(边缘轻度高出表皮)2中等水肿(边缘高出表皮1mm)3重度水肿(边缘高出表皮1mm以上并超过涂抹范围)4红斑、焦痂评分标准

以水肿过程为评分标准

皮肤反应评分表由于皮肤局部刺激损伤往往发展过程缓慢，一般评价24小时反应或72小时反应，取其平均值，称为“原发性刺激指数”。指数＜2分轻度刺激指数2-5分之间中等刺激指数>6分重度刺激4．注射途径接触是研究外源化化学物毒性作用的特殊方式，一般仅用于几种化合物毒性的比较，化学物的代谢、毒物动力学或药物的研究。静脉注射；皮下注射；腹腔注射；肌肉注射等。

五、急性毒性替代试验＊固定剂量法＊急性毒性分级法＊上－下移动法1、固定剂量法不以动物死亡为观察终点，预先选定的或固定的一系列剂量染毒，如5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。观察毒性反应，对化学物毒性进行分级。

EEC的急性经口毒性分级标准为：高毒(LD50<25mg/kg)有毒(LD50为25－200mg/kg)有害(LD50为200－2000mg/kg)不分级(LD50>2000mg/kg)平均用大鼠14.8只，经典方法平均用大鼠24.2只。2、急性毒性分级法以死亡为终点的分阶段试验法，每阶段3只动物，平均经2～4阶段，根据死亡动物数，判断急性毒性。首选大鼠，从25、200、2000mg/kg体重3个固定剂量中选择一个剂量开始试验，根据结果判断：①不需要进一步试验进行分级；②下一阶段以相同剂量的另一种性别试验；③下一阶段以较高或较低的剂量水平进行（从200mg/kg体重开始）。动物观察14天，染毒当天观察体征和死亡至少两次，之后每日观察一次。每周测体重，所有动物进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查。3、上－下移动法（阶梯法）以死亡为终点，也可用于观察不同的终点。根据初步资料确定第一只动物接受化学物的剂量，由第一只动物染毒后的反应决定第二只动物的接受剂量，如死亡则下一个剂量降低，如存活则下一个剂量增高。该方法需要选择一个比较合适的剂量范围，使得大部分动物的所接受的化学物剂量在真正的平均致死剂量左右。方法改进后，仅需要6～9只动物。六、毒性作用观察1.观察时间一般要求的观察时间为14天许多化学物在动物接触后很快死亡，如有机磷农药、氰化物。也有些化学物所致的中毒症状发展迟缓，可出现迟发性死亡，如羰基镍、铊。另外，由于动物个体差异，死亡时间也不同。如小鼠腹腔注射过氧化二碳酸二环己酯（DCPD），同一组动物的最早死亡时间为注射后7小时，最迟为150小时（6天）。观察时间可随具体情况设为24小时，3天，7天等。如观察时间过长超过14天，有时不能区分动物是由于中毒死亡，还是因其它原因所致，因而也无必要。值得注意的是，任何LD50或相关参数测定，均应标明接触时间。2.症状观察目的：观察外源化学物急性毒性的重要环节，同时可以弥补LD50参数的不足。内容：中毒的发生、发展、规律；体重改变；死亡前症状、特点，死亡时间等。啮齿类动物化学物中毒主要观察内容

系统和器官中毒后常见表现中枢神经系统和神经肌肉系统体位异常,叫声异常,活动增多,呆卧少动,肌颤,痉挛,抽搐麻痹,后肢无力,运动失调,管状尾,对外界刺激过敏或迟钝植物神经系统瞳孔扩大,流口水,流泪,出汗呼吸系统鼻孔溢液,鼻翼煽动,呼吸深缓,呼吸过速,张口或腹式呼吸泌尿生殖系统会阴部污秽,有分泌物,阴户或乳腺肿胀,阴茎突出,遗精皮肤和被毛皮肤充血,紫绀,被毛蓬松,污秽眼睛眼球突出,充血,角膜浑浊,血性分泌物有的化学物能够使动物很快出现兴奋症状，如氰氢酸和丙烯腈对大、小鼠染毒后，都很快出现兴奋。有的化学物给动物染毒后，动物出现抑制现象，直至死亡。例如：除草剂新燕灵给大、小鼠灌胃致死剂量，动物很快表现为闭目静卧、四肢无力、站立不稳、步态蹒跚、呼吸减慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。有些化学物结构相似，但毒性表现也有差别。含有氨基的氰氢酸和丙烯腈对大、小鼠染毒后，都很快出现兴奋。染毒丙烯腈的动物首先出现活动增加、骚动、窜跑、甚至跳跃，之后出现呼吸困难，耳与尾青紫色；而氰氢酸呈一过性兴奋，呼吸加快、加深，然后呼吸困难，耳与尾则为桃红色。可见同为氰化物，其中毒表现和机制有所不同。在观察期内还需多次测量动物体重，体重改变可以反映动物染毒后的整体变化。实验动物染毒后的死亡时间也应记录和分析，有时死亡时间的分析可以提供一些重要信息。久效磷小鼠经口与腹腔注射染毒，均呈现随染毒剂量增加，死亡时间缩短，死亡时间与染毒剂量之间呈直线负相关，提示实验动物致死是可能由于化学物原形所致。DCPD给大鼠腹腔注射染毒，染毒剂量对数值与死亡时间呈明显负相关；但给小鼠腹腔注射染毒，则无明显相关。可能与化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。

3.病理和其它指标观察对死亡的动物应及时做大体解剖检查，观察内脏器官有无出血、坏死等，对有变化的器官应进行病理组织学检查。如果有阳性发现，应以此为线索，进行下一步研究，为之后的亚慢性和慢性毒性试验提供参考观察指标。第二节急性毒性试验程序

与急性毒性评价一、急性毒性试验程序受试物资料的采集：化学结构式、理化性质、纯度等，或查阅文献，搜集与之相近的化学物毒性资料。实验室的要求：GLP。实验动物的选择原则，年龄和体重等。实验动物的分组的随机性与均衡性。受试物剂量的分组确定。选定染毒途径，符合人类实际接触情况。中毒表现的观察，相关参数的计算。毒性分析。二、半数致死量与急性毒作用带1.LD50（LC50）应用中需注意的问题:

1927年Trevan引入了半数致死量LD50（LC50）的概念来评价急性毒性，此后该指标得到广泛应用，并成为急性毒性的主要指标。①LD50（LC50）的波动性LD50（LC50）是一个统计量，它受到许多因素的影响，包括实验动物的物种、品系、性别、年龄、受试化学物的浓度、稀释溶液的性质、喂养条件以及操作者的熟练程度等。因此，在比较不同实验室的LD50时要考虑到各种影响因素的存在，以及实验条件的等同性。另外，即使各个条件都相同，由于实验动物的抽样误差，LD50的差别依然存在。

同一化学物不同实验室LD50测定结果的差异

染毒途径毒物总数平均差异倍数最大差异倍数经口20513吸入203.811皮下301.874.8经皮未说明1.744腹腔251.251.8曾经有研究组织13个国家的11个实验室，统一主要的实验条件对5种化学物的LD50进行测定。根据收集到的80个实验结果分析，结果仍存在相当大的差别，可达2.44~8.38倍。

化合物范围（mg/kg）比值（max/min）五氯酚74~6208.38水杨酸钠930~23282.50苯胺479~11692.44乙酰苯胺723~30604.23氯化镉105~4824.59LD50（LC50）虽然是一个重要的急性毒性参数，但它只能表示一种外源化学物引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度)，即一半死亡、一半存活的剂量界限，所以它是一个质反应。LD50（LC50）给予有效信息较少，实用性有限，有其局限性，表现在它不能反映急性毒性作用的特征，也不能反映其毒作用带的宽或窄。因此，为弥补LD50（LC50）的不足，实验中还要详细描述实验动物的中毒特征，并选择其它的参数，如急性毒作用带。②LD50

（LC50）的局限性2.急性毒作用带急性毒作用带（acuteeffectzone，Zac），即化学物急性毒性的上限与下限的比值，通常急性毒作用带中，死亡剂量用LD50表示，最低作用剂量采用急性阈剂量（阈浓度）(Limac)表示:Zac=Z