蛋白质组学的研究方法与及其进展医学课件

专题六蛋白质组学的研究方法与及其进展蛋白质组学的概念及其发展史第一节1、Proteome&ProteomicsProteome：

1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出“proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome”“proteome”是由protein一词的前几个字母“prote”和genome一词的后几个字母“ome”拼接而成一、概念对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。在空间和时间上动态变化着的整体。Proteomics定义蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学它在本质上指的是在大规模水平上、整体角度研究蛋白质特征：细胞内动态变化的蛋白质组成成份表达水平（量）翻译后的修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识2.功能蛋白质组(functionalproteome)1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。3、Proteome与Genome关系互补的角度/空间来研究细胞的分子架构相辅相成

Genome剧本

Proteome演员Proteome与Genome区别稳定性：Proteome动态Genome静态特异性Proteome组织和细胞特异性Genome无组织和细胞特异性复杂程度Proteome高（20aa+高度多样性修饰）Genome低（4nt）修饰化程度Proteome高Genome低孤立行为与相互作用：Proteome相互作用

Genome孤立

二、蛋白组学的产生与发展1、产生背景

基因组时代→后基因组时代研究重点的转移

基因组研究主要包括两方面的内容:

以全基因组测序为目标的结构基因组学(StructuralGenomics)

以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(FunctionalGenomics),后者又往往被称为后基因组学。

人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP，1990年启动）2023/10/2614Bioinformatics2000年6月26日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成2023/10/2615Bioinformatics

功能基因组学利用基因组所提供的信息和产物,应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,力图从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。mRNA水平的基因表达研究取得进展，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5

蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平上解答其活动规律

对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。2、进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA（美国生物评价与研究中心）共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。

1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议

1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议

1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议

我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会

2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。

科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究蛋白质-蛋白质相互作用研究蛋白质高级结构的解析目前仍独树一帜3、发展趋势蛋白质组学研究趋势在基础研究方面蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域在应用研究方面 蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一在技术发展方面研究方法将更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征蛋白质组学与其它学科的交叉互动日易显著存在的问题

蛋白质组学为一种新生领域，目前还处于初期发展阶段，仍有许多困难有待克服。

第二节蛋白质组学研究方法蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。蛋白质性质各异。

传统的蛋白质研究方式无法满足需要生命现象的发生往往是多因素影响的，涉及多个蛋白质多个蛋白质的参与是交织成网络的在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的

传统对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求

发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。

当前主要任务

蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的蛋白质组学研究思路与方法策略条件基本路线技术一、研究策略两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程（应用最广泛、最成熟） （Gel-basedworkflow）基于液相色谱的工作流程 （LC-basedworkflow）蛋白质组学的经典方法

双向电泳与生物质谱联用（two-dimensionalgelelectrophoresis/massspectrometry，2-DE/MS），这两种方法结合起来可以对复杂样品进行预分离、对低丰度蛋白进行富集，还可以完成蛋白酶解后多维液相分离选择哪种方法，哪个试验流程来分析，需要研究人员根据不同的蛋白特性、样品种类以及研究方向和经费决定二、蛋白质组学实验室所需的条件三、蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据多肽指纹图数据搜索生物信息学分析和比对新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定胰酶对脱色后蛋白质的消化获得蛋白初步信息四、实验技术(1)用于蛋白质分离技术方面的如双向凝胶电泳、双向“高效”柱层析等。(2)用于蛋白质鉴定的技术如质谱技术、凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等。(3)用于蛋白质相互作用及作用方式研究的噬菌体展示技术和大规模双杂交系统。(4)用于分析大量数据的生物工程信息学等。蛋白质组研究技术常用以下手段:

（一）样品的制备

通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。

也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等

样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。样品制备一般方法

对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活或还原,尽可能断开蛋白质间的连接键,提取全部蛋白质对溶解度差的蛋白质(如膜蛋白)和具有高抗性组织(如皮肤)的蛋白质,则需要添加破膜剂、兼性离子表面活性剂等,以增加蛋白质的溶解度,提高提取率。双向凝胶电泳常规样品制备培养细胞蛋白质样品制备组织样品制备分泌蛋白质样品的制备体液蛋白质样品的制备激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。

根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性质、生物学功能的差异进行分离（二）蛋白质组研究中的样品分离

蛋白质组分离的难点：量的问题：不同的蛋白质数量在细胞内可以有很大的差别。酵母细胞内，有些细胞周期调控蛋白不到100个分子，二糖基酶可能有200万个分子。估计蛋白质量的动态差别可达到106数量级。质的问题：不同的蛋白质的物理化学性质差别很大

双向凝胶电泳目前仍然是蛋白质组学研究的主要分离方法最有实用价值双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。高分辨双向凝胶电泳1975年首先由O’Farrell等创立。1、概念2、原理

第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEFisoelectrofocusing),

再在第一向垂直方向上，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)。

IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术

第一向IEF电泳

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI蛋白质的兼性离子阳离子阴离子PrPrCOO-NH3+PrCOO-NH2PrCOOHNH3+将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带从而得知其等电点信息根据第一向等电聚焦方式和条件的不同，将双向凝胶电泳分为三种系统:1)ISO-DALT系统

(isoelectricfocusingfollowedbyseparationwithrespecttomolecularmassexpressedindaltons)2)NEPHＧＥ（nonequilibriumpHgradientelectrophoresis）非平衡pH梯度电泳

3)IPG-DALT（immobilizedpHgradientelectrophoresis）固相pH梯度等电聚焦1)ISO-DALT系统

第一向应用载体两性电解质,在胶管内建立ｐＨ梯度该系统的缺点是pH梯度不稳定(如阴极漂移)、重复性差、上样量低，故不利于不同实验室之间进行图谱的比较和数据发布；目前唯一分辩率达到10000个蛋白质斑点的图谱采用了这一系统2)NEPHＧＥ（非平衡pH梯度电泳）

应用载体两性电解质,在胶管内建立ｐＨ梯度

蛋白质样品被加在pH7～10或pH3.5～l0的凝胶的酸性部分进行分离，电泳时间相对比较短。旨在克服平衡pH梯度电泳时的严重阴极漂移和碱性蛋白的丢失。在等电点区域的迁移须在平衡状态之前完成。如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失。但很难控制，因此重复性比较差

发展于80年代早期.第一相采用IPG胶，其梯度的形成依赖于一些具有不同pK的化合物——固定化电解质.

该化合物是丙烯酰胺的衍生物，一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的缓冲基团R为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可形成近似线性的pH梯度

3)IPG-DALT（固相pH梯度等电聚焦）固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的不同：

前者在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。

固相pH梯度等电聚焦产生固定的ｐＨ梯度,基本克服了ISO-IEF的缺点。从而达到高度的重复性。这是目前蛋白质组学研究中用得最多的双向电泳体系

IPG-IEF电泳仪PAGE凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。SDS处理蛋白后，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关

从而得知其分子量信息第二向垂直SDS电泳

SDS电泳仪EttanDalttwelve电泳系统2-DE原理示意图3、2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计

第一相电泳：IPG－IFE平衡第二相电泳：SDS－PAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色凝胶的图像处理分析斑点检测原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白

双向凝胶电泳样品制备

1）考马斯亮兰染色法；

2）银染法；

3）负染法；

4）荧光染色法；

5）放射性同位素标记法等染色：

2-DE

凝胶蛋白质斑点的检测

通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。

图像扫描和分析——ImageScannerII凝胶的图像处理分析

典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：2-DE

凝胶蛋白质斑点后续分析取点全自动斑点切取系统（EttanSpotPicker）

人工或自动化仪器酶切胶內酶切电洗脱后在溶液中酶切电转移到膜上后在膜上酶切在印迹过程中酶切4、2-DE技术的特点可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配5、2-DE技术的缺点

极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。

胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。非凝胶技术

液相色谱法liquidchromatography，LC毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE液质联用技术（LC-MS/MS）

蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。

质谱（MS）法

1、基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。

质谱是指记录裂片的相对强度按其质荷比的分布曲线。（三）蛋白质组研究中的样品鉴定2、质谱仪一台质谱仪一般由进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。早期质谱技术采用电子轰击电离,能量太强，而生物大分子结构复杂且热不稳定，电子轰击不适于生物大分子分析，仅应用与小分子研究领域。20世纪80年代，电喷雾离子化和基质辅助激光解析离子化的出现和应用，才使质谱技术真正进入到生物大分子分析领域。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）用于蛋白质分析的主要质谱类型“软电离”的特点没有直接的外界能量作用于分子,分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。

电喷雾质谱（ESI-MS）基质辅助激光解析离子化（MALDI）：

是将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。特点：离子电荷通常为1或2个，而不像ESI中为多电荷，对分子质量较大的样品而言，不会形成复杂的多电荷图，因而对图谱的解析比较清楚。由于MALDI的进样是固相方式，不像ESI的液相进样容易受溶液性质的影响，因此对杂质的忍耐性较好

3、质谱法鉴定和注释蛋白质通过肽质谱指纹图和数据库搜寻匹配

通过测出样品中部分肽段一级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配

肽质谱指纹图谱

（peptidemassfingerprinting，PMF）：

每一个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质应是专一而特异的，因此称为肽质量指纹图谱。比传统方法速度快、通量高，是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。部分肽段一级质谱信息、氨基酸序列标签法鉴定蛋白质

在MS/MS或PSD（肽序列标签）-MS对肽段的序列分析中，通常获得的是部分序列，特别是肽段中段的序列，根据肽段的部分序列和序列两端的肽质量，可以对肽段进行鉴定。实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）肽混合物质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)肽质谱指纹图肽质量检索解析碎片离子检索酶切质谱鉴定蛋白质的策略4、质谱法-应用1)样品元素组成分析2)无机、有机生物定性、定量分析3)复杂混合物的定性定量分析4)固体表面结构和组成分析5)样品中原子的同位素比现有鉴定技术面临的最大问题是，它们都依赖于已知的蛋白质或基因的序列作为检测的基础，通过比较来确定待测的蛋白质。对于在已有数据库中没有记载的全新蛋白质必须进行“从头测定”，一般是通过经典的Edman降解法测定氮端序列或化学降解法测定碳端序列，这是困难繁琐的任务

全新蛋白质的鉴定传统方法氨基酸组成分析蛋白质微量测序分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。（四）蛋白质相互作用研究技术生化方法分子生物学方法遗传学方法基于质谱的方法

蛋白质亲和层析亲和印迹免疫沉淀交联

酵母双杂交噬菌体展示生物传感芯片质谱蛋白质工程中的定点诱变技术

研究技术传统技术新技术

1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。

利用酿酒酵母的GAL4/Lex蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）的报告基因表达，从而判断两种蛋白分子间是否发生了相互作用的方法。

1．酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）

根据BD来源的不同主要分为:

GAL4系统

LexA系统i.

GAL4蛋白质功能：是一个转录因子，在酵母中控制半乳糖利用酶类基因的表达（这些基因的5’-端存在UAS序列），激活这些基因UAS的下游启动子；ii.

GAL4结构特征：存在两个结构域

N-端(1-147)具有UAS-DNA结合域(DNA-

bindingdomain,

BD)

C-端(768-881)具有转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain,AD)1)

GAL4系统

这两个结构域各具功能，互不影响，可单独存在。但只有在两者相互结合或通过适当的途径在空间上较为接近时，才能呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活其报告基因UAS的下游启动子，使启动子下游基因（报告基因）得到转录。iii.

如果将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD靠近形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。酵母的双杂交系统示意图2)酵母双杂交系统的组成

(1)与BD融合的蛋白表达载体。被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)，融合的基因称诱饵基因(2)与AD融合的蛋白表达载体。被其表达的蛋白称靶蛋白preyprotein/随机蛋白库libraryprotein(3)带有一个或多个报告基因（能显示诱饵和靶蛋白相互作用的基因）的宿主菌株。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因，菌株则具有相应的缺陷型。LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+mediaLEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)常用的报告基因酵母双杂交工作原理酵母双杂交模型3）主要特点和优势使蛋白质表现型和基因型相联系筛选cDNA文库真实反应体内蛋白质间相互作用情况不需分离靶蛋白敏感性高4）应用1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图5）缺点1.假阳性结果2.假阴性结果3.限于核内表达的蛋白质的相互作用

假阳性技术假阳性蛋白的非特异性结合，形成稳定的复合物，激活报告基因

靶蛋白无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录

（这是大多数假阳性的诱因）生物学假阳性

能发生物理相互作用,但不与生理学相关假阴性

用酵母双杂交技术检测不到许多已知的相互作用。造成假阴性的原因有蛋白质不正确折叠、亚细胞定位不准、嵌合蛋白的降解或酵母中缺乏特定类型的翻译后修饰等细菌双杂交系统1998年，Karimova等建立细菌双杂交系统，弥补了酵母双杂交的缺陷。与酵母双杂交的原理相似，该系统利用百日咳博代杆菌中编码的钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶的2个相对独立的催化结构域T18和T25，分别与待研究蛋白质融合，在腺苷酸环化酶缺陷型大肠杆菌中进行表达，如果蛋白质间存在相互作用，则T18和T25片段恢复完整结构域，催化形成cAMP，从而激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操纵子的表达，产生可以识别的表型变化。细菌双杂交系统优点研究周期短，操作简单，拥有更大容量的筛选文库，转化效率高；选择细菌作为筛选宿主，降低了对研究蛋白核定位的要求；且细菌遗传体系的基因复杂性更小，与高等生物进化距离更远，避免了内源蛋白引起的假阳性现象，能得到一些用酵母双杂交系统研究时无法得到的结果。2．噬菌体表面展示技术(phagedisplay)

以噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的基因，使其基因表达产物在噬菌体表面展示，进而通过亲和富集法筛选特异肽或蛋白质的方法。噬菌体展示系统丝状噬菌体展示系统λ噬菌体展示系统T4噬菌体展示系统T7噬菌体展示系统等丝状噬菌体展示系统

基因组均为单链环状DNA，大小约6.4kb，共编码10个不同的外壳蛋白质，与表面展示有关的蛋白质主要是由基因Ⅲ(g3)和基因Ⅷ(g8)编码的外壳蛋白gp3和gp8，分别可构成gp3和gp8展示系统。gp3和gp8蛋白的N端均游离在外，外源肽通过柔性接头（linker）与其N端连接，然后外源肽或蛋白质以融合的形式表达出来并分泌到胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白组装成熟，呈现在病毒粒子的表面。不影响和干扰噬菌体的生活周期，而且同时保持了外源蛋白天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别噬菌体展示技术的原理LeadProteinLinkPIII融合蛋白PIII基因型表达型利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。噬菌体表面展示的步骤1、不同基因分别被插入噬菌体基因组中。

2、分离纯化的噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者抗体。收集所有的噬菌体就构成一个文库。

3、将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体

重组噬菌粒的构建示意图噬菌粒表达载体pCANTAB-5E

蛋白文库的构建SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvvImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBWashtoremoveunboundphageparticles.EluteboundphageAmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和扩增

目的蛋白的富集筛选吸附-洗涤-洗脱-扩增3～5轮103～105富集主要应用筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质

研究抗体或受体的结合位点构建随机肽库、抗体库和蛋白文库

改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性

研究新型多肽药物、疫苗和抗体

研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统

3．基于质谱的蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备

蛋白质复合体的纯化

蛋白质复合体的质谱鉴定基本步骤：（1）亲和层析耦联质谱技术

（2）免疫共沉淀耦联质谱技术

（3）生物传感器耦联质谱技术

（4）串联亲和纯化耦联质谱技术

（五）蛋白质组学研究的生物信息学

生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。

构建和分析双向凝胶电泳图谱

数据库的搜索与构建应用

蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB数据库是由NCBI创建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默认蛋白质序列数据库该数据库是一个较完全的，包含最新信息的数据库。

dbEST数据库

由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（EST）

肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻数据库说明WWW地址蛋白质序列库:SWISS-PROT内容丰富,提示详尽http://www.expasy.ch/sport/PIR较/pir/pir-psi.htmlTrEMBL(EMBL的翻译)http://www.expasy.ch/sprot/OWL(非冗余库)http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html核苷酸数据库:EMBL欧州分子生物学http://www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美国生物工程信息中心/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列标记/dbEST/模体与域:PROSITE序列模体http://www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS保守序列http://www./ProDom蛋白质域http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白质域http://base.icgeb.trieste.it/sbase/二维电泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE国际2DPAGE库的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的连络表/links.htm2DWG二维电泳图谱元库/2dwgDB/Flicker成对电泳图谱比较/flicker/三维结构库:PDB蛋白质三维结构坐标库/SWISS-MODEL从序列模建结构http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.htmlSWISS-3DIMAGE三维结构图示http://www.expasy.ch/sw3d/DSSP二级结构命名ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dsspFSSP蛋白质结构家族ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/翻译后修饰:O-GLYCBASE糖基化http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/PHOSPHOBASE磷酸化http://www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/deltamass翻译后修饰汇编.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html基因组库:dblist基因组库目列http://www.expasy.ch/amos-www-links.html#organismsGDB基因组库/OMIM遗传病表型/omim/GeneCards生物医学知识http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/代谢库:Boehringer图代谢路径图http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-indexENZYME酶及其反应的命名http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.htmlEcolyc大肠杆菌中间代谢/ecocyc/ecocyc.htmlHinCys嗜血流感中间代谢/ecocyc/hincyc.htmlWIT酶和代谢途径/WIT/相互作用:GIF-DB果蝇发育中的基因相互作用http://gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home.htmlKEGG基因相互作用http://www.genome.ad.jp/keggDeletion酵母功能基因组/group/yeast-deletion-project/deletion.html

表3用于蛋白质鉴定的数据库搜索软件属性参数/软件名称WWW地址蛋白质质量+蛋白质序列标记PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白质的肽质印记:MassSearchhtt