第七章 酵母基因工程2X

第七章

酵母基因工程第二节常见的酵母基因表达系统本章内容第一节酵母基因工程表达体系第四节酵母基因工程应用举例---利用重组酵母

生产乙肝疫苗第三节影响外源基因表达的因素酵母菌的分类学特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由56个属和500多个种组成。酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。第一节酵母基因表达体系----宿主系统作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求①安全无毒，没有致病性。②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。④培养条件简单，容易进行高密度发酵。⑤有较强的蛋白质分泌能力。⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统酵母菌是最简单的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵亚母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。

假丝酵母属产朊假丝酵母(Candidautilis)酵母菌表达系统的选择

酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。

酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。

乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。

乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。表达系统优势：生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表达

由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有“十二五”普通高等教育国家级规划教材

多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列多型汉逊酵母表达系统HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多

目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。系统中获得成功表达。“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母中的2m环状质粒同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。第一节酵母基因工程表达体系

--------载体“十二五”普通高等教育国家级规划教材第一节酵母基因工程表达体系

--------载体酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材第一节

酵母基因工程表达体系

-------载体1．酵母载体的基本结构

DNA复制起始区：2μ质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）

筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选

整合介导区

有丝分裂稳定区

表达盒：

启动子，基因（分泌信号序列），终止子“十二五”普通高等教育国家级规划教材2酵母载体的种类酵母整合型质粒YIp：缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因。具有整合介导区，所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定(a)。酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分为下列五类：酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类“十二五”普通高等教育国家级规划教材含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建

在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高（b）。

酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个（c）。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材

ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。

以ARS为复制子的质粒称为YRp

上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，

以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。“十二五”普通高等教育国家级规划教材2酵母载体的种类酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。

CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp.YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。

YAC载体在宿主细胞中以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb的外源DNA片段。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材主要结构：

①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；③一个自主复制序列(ARS1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点；⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌的转化方法用于转化子筛选的标记基因“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌转化方法原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。Li+盐转化方法：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌转化方法电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105/mgDNA）。PEG转化法：PEG1000“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母细胞转化特点单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或同源整合入染色体（不含复制子）克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%“十二五”普通高等教育国家级规划教材用于转化子筛选的标记基因

营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因“十二五”普通高等教育国家级规划教材用于转化子筛选的标记基因其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因aph

氨基糖苷转移酶抗G418

cat

氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr

二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

铜离子螯合物耐受铜离子suc2

蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型“十二五”普通高等教育国家级规划教材第二节常见的酵母基因表达系统一、酿酒酵母表达系统1，启动子

组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）

“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭23℃诱导表达温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性a–a

型启动子酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型温度控制型启动子a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型启动子

受体细胞基因组

重组质粒a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型启动子a2a125℃35℃（–）“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性酿酒酵母超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1

GAL7和

GAL10基因编码“十二五”普通高等教育国家级规划教材杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母表达载体目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp)（见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp)；（4）酵母整合型质粒(YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序列，能够自主复制，通常为多拷贝数“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母宿主

有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1

改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2

提高重组蛋白表达转录后加工rgr1

提高重组蛋白表达转录水平ose1

提高重组蛋白表达转录水平ssc11

改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母宿主

为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应

许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。

酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌有四个泛素编码基因：UBI1

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3

编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4

编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能UBI4缺陷型：外源基因表达理想的受体正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，UBA1缺陷型：减少蛋白降解UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：减少蛋白降解七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效“十二五”普通高等教育国家级规划教材二、毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统

1.启动子

（1）AOX1和AOX2启动子（2）三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）启动子（3）甲醛脱氢酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）启动子“十二五”普通高等教育国家级规划教材2毕赤酵母表达载体类型胞内表达载体pPICZA,B,C分泌型表达载体pPICZaA,B,C“十二五”普通高等教育国家级规划教材毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重组整合入酵母染色体DNA中，并随酵母的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生。3载体的整合方式依据具体整合位点及相应产生的转化子的类型可分为三种情况：“十二五”普通高等教育国家级规划教材5’AOX1和3’AOX1与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因。这种情况有功能的AOX1基因被替换而丢失后，只能利用弱的AOX2基因启动合成AOX，就产生His+MutS表型(methanolutilizationslow)，在含甲醇的培养基中生长缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发生置换，使得一个或多个表达单位插入在his4位点，产生的表型也是His+Mut+染色体AOX1区与载体质粒的AOX1区发生单位点互交换，外源基因的表达单位插入在基因区AOX1基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种情况AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产生的表型是His+Mut+。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材在毕赤酵母中有3种方法可以得到多拷贝表达菌株。第一种方法直接构建含高拷贝外源基因的表达载体，在体外利用同尾酶向载体中多次插入首尾相连的表达盒。此法的优点是一次整合，即可有多个表达盒插入染色体。但体外基因操作较繁琐。第二种方法是利用含有kanr基因的载体。细菌来源的卡那霉素抗性基因在酵母中赋予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致与载体的拷贝数相关。提高抗生素G418的浓度可以得到含高拷贝表达载体的转化菌株。第三种方法是用含有Zeocin抗性标记基因Shble的载体来构建多拷贝菌株。来源于细菌的Shble在酵母中赋予宿主对抗生素zeocin的抵抗能力，通过提高zeocin浓度可筛选出含高拷贝表达载体的转化菌株。然而与G418筛选相似，大多数能抵抗高水平zeocin的转化子并不含有多载体拷贝。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材4宿主常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168为蛋白酶缺陷型，以其作为宿主表达蛋白可以降低表达产物的降解。这些表达宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生来的。最常用的受体菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一个组氨醇脱氢酶缺陷型基因His4，可接受含His4的载体而具有His+表型来筛选转化子。根据对甲醇利用的情况，毕赤酵母可划分为三种表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；当AOX1被其他基因取代，则需依赖AOX2，但其甲醛代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为甲醇利用负表型（Mut-），如MC100-3。后两者胞内表达外源蛋白质有时优于野生株，且需甲醇较少。此外为增加分泌蛋白质稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。“十二五”普通高等教育国家级规划教材第三节影响外源基因表达的因素外源基因稳态mRNA的浓度优化翻译起始区前后mRNA的二级结构，提高外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的一、转录水平控制二、表达载体的拷贝数和稳定性三、其他因素“十二五”普通高等教育国家级规划教材优化工程菌发酵工艺避免表达产物在细胞内的降解，选择或改造宿主，如：采用二倍体宿主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为宿主第三节影响外源基因表达的因素“十二五”普通高等教育国家级规划教材

利用重组酵母生产乙肝疫苗第四节酵母基因工程应用实例

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

利用重组酵母生产乙肝疫苗产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质

乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，病毒颗粒呈乙型肝炎病毒的结构球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、

此外，被乙肝病毒感染的人肝脏还能合成并释放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是各种未装配的包装蛋白的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的传统乙肝疫苗的制备乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞膜上提取出来的。这种来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。“十二五”普通高等教育国家级规划教材产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母

20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。

目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。

进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。“十二五”普通高等教育国家级规划教材产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+的转化子重组