高级生物化学历年试题及答案

2010年高级生化考试题蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组：一个细胞或组织或机体所包含的所有蛋白质，现定义为基因组表达的全部蛋白质。具有三种含义：一个基因组、一种生物、一种细胞所表达的全部蛋白质。疏水作用层析：就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。DNA的三级结构：DNA分子通过扭曲和折叠形成的特定构象。核酸的三级结构反映了对整体三维形状有影响的相互作用，包括不同二级结构元件间的相互作用，单链与二级结构间的相互作用以及核酸的拓扑特征。DNA的四级结构：共价催化：在酶催化反应过程中，酶与底物以共价键结合成中间物过滤态以加速反应。即在催化时，亲核催化剂或亲电催化剂能分别放出点子或汲取电子，并作用于底物的缺电子反应中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价键中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。Kcat型不可逆抑制剂：这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶共价共价修饰而失活。Ks分段盐析法：在一定的pH值和温度条件下，改变盐的离子强度I值，使不同的溶质在不同的离子强度下有最大的析出，此种方法称为Ks分段盐析法。β分段盐析：保持溶液的离子强度不变，改变溶液的pH值和温度，使不同的溶质在不同的PH值和温度条件下台最大的析出，此种方法称为β分段盐析法。cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。穿梭载体(shuttlevector)：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.后生遗传：指通过遗传而产生的基因表达修饰，且不能被逆转，此类遗传改变主要指染色体结构的改变和DNA甲基化状态的改变。对角线电泳：用于分析混合物中某一组分对某些化学处理或光处理后变化的双向电泳技术。样品加样后先从一个方向进行电泳分离，经化学或光处理后，再以与第一次电泳垂直方向进行第二次电泳分离，则经过处理未被修饰的组分皆位于电泳图谱的对角线上。化学酶工程：也称初级酶工程是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。生物酶工程：是用生物学方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶；它是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。酶提取的回收率：每次提纯后酶制剂总活力与提取液的总活力的百分比。1,miRNA和siRNA，及其功能（网上搜索所得）SiRNA的主要特征：长约21到23nt；双链的3’端各有2个或3个突出的核苷酸；5’端磷酸化，3’端为自由的-OH基团。siRNA可作为一种特殊引物，在RNA指导的RNA聚合酶作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA，新生成的siRNA又可进入上述循环。这种过程称为随机降解性多聚酶链反应。MicroRNA(miRNA)：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。miRNA的特点：广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框架(ORF);通常的长度为20～24nt,但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化;成熟的miRNA5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。2，核酸结构与功能的关系。３，什么是southern杂交，怎样控制其严紧程度。（不准确）southern印记法是将凝胶上分离的ＤＮＡ片段，转移到硝酸纤维素膜上后，再通过同位素标记的单链ＤＮＡ或ＲＮＡ探针的杂交作用检测这些被转移的ＤＮＡ片段的方法。分子杂交的严紧程度主要取决于复性温度及溶液中盐与甲酰胺的浓度。强的碱基对能忍受高的温度。高的盐浓度能使弱的碱基对间的配对变得稳定。所以高温，低盐浓度，高浓度的甲酰胺形成高严紧行杂交分子。4，磺酸型阳离子交换树脂层析原理：离子交换树脂是人工合成的，具有酸性基团和碱性基团，并具有网状结构的高聚物。①用pH3.25柠檬酸钠缓冲液平衡树脂，将其处理为钠型。②把氨基酸混合液调pH至2.2(pH＜pI)，小于等电点，在低PH离子强度下，由于缓冲液氢离子浓度大，氢离子解离被抑制，使氨基酸带正电荷。③灌注：由于静电引力，带正电荷的氨基酸被树脂吸附，与树脂上的钠离子发生交换，将钠离子交换下来。④洗脱用pH逐渐增高的缓冲液洗脱，当洗脱液相继流经树脂时，由于PH不断升高，蛋白质逐渐失去电荷，因而与树脂的结合能力下降，最后从树脂上冲洗下来。不同的氨基酸与树脂的结合能力不同，被洗脱的顺序也不同，可逐一得到不同的氨基酸。5，蛋白质中二硫键的定位（见黄刚的）一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。6，温度影响酶活性的机理：1）、温度影响反应体系中的活化分子数，：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。化学反应中温度每增加10度反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。酶促反应的Q10为1~2。2）、温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速率下降。PH影响酶活力机理：1）、PH影响酶和底物的解离。2）、PH影响酶分子的构象。过酸或过碱环境可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失；当PH值变化不是太剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响；Ph影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。7，酵母双杂交系统的原理：该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(BD)，转录激活结构域(AD)。这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。理论上，任何一个AD都可以与任何一个DNA-BD结合并转录激活，即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白，不仅如此，只要DNA-BD和AD能够通过一定的方式在空间上足够靠近，将相互分开的DNA-BD和AD在空间上彼此靠近，并重建一个具有功能的转录激活蛋白。单独的DB虽然能和启动子结合，但不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然有正常的激活转录的功能。将编码已知蛋白质（诱饵蛋白）的基因与编码BD的序列融合并在酵母中表达产生融合蛋白BD－Bait，同时将编码未知蛋白（猎物Prey或靶蛋白）的基因与编码AD的序列融合并在酵母中表达产生另一种融合蛋白AD－Prey。借助Bait和Prey的作用使BD和AD相互结合并产生具有功能的转录激活蛋白，从而激活报道基因。如果Bait和Prey不能相互作用，则BD和AD不能结合，报道基因的转录不能被激活，因此，可以通过检测报道基因是否被转录来研究蛋白质之间的相互作用。通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为诱饵和猎物的两个蛋白质之间是否存在相互作用。8细胞内酶活性调节方式：1）、变构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，发生构象的改变，进而改变酶的活性状态。2）、共价修饰调节：通过其他酶对其多肽链上的某些基团进行了可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。3）、酶原激活：体内合成的蛋白质有时不具有生物活性，经过蛋白质水解专一作用后，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成活性蛋白，该活化过程是生物体的一种调节机制。2008年高级生化考试答案一、名词解释1、cDNA文库：由细胞全部mRNA反转录生成的cDNA克隆的总和。2、DNA指纹：在人类中VNTRs位点是1.5kb，但人的总DNA提取后用限制线内切酶切成不同的片段，然后以ANTRs中的特异序列为探针进行southern杂交，可发现阳性片段的大小各不相同，由于不同个体的这种串联重复的数目和位置各不相同，所以VNTRs的southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，称其为DNA指纹，可作亲子鉴定。3、后生遗传：指不处于DNA自身的核苷酸序列中的可影响DNA活性的任何可遗传的物质。4、穿梭载体：通常指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。5、亲和层析：蛋白质分子能对配基专一性地结合成复合物，改变条件，又能分离，利用这种特性而设计的一种层析技术。6、减数Edman蛋白质测序法（DNS-Cl-Edman法）：将高灵敏度的DNS技术与能连续降解的Edman反应有机结合起来的一种测定氨基酸排列顺序的方法。7、二面角：由C2-N1单键旋转和C2ɑ-C2单键旋转角度决定的相邻二个肽平面在空间上的相对位置的夹角。8、蛋白质完全水解：即将所有的肽键都打断，使蛋白质完全裂解为氨基酸。蛋白质部分水解：即将蛋白质的部分肽键打开，进而部分地分离出所需氨基酸。9、酶的化学修饰：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。具有这种性质的酶称为化学修饰酶。10、邻近效应：E与S形成中间复合物后，S与S（双分子），酶催化基团与S之间结合于同一分子，使有效浓度大大提高，使反应速度大大增加。定位效应：反应物的反应基团之间和催化基团与S的反应基团的正确取位产生的效应。11、酶催化的过渡态理论：酶促反应中，酶与底物的过渡态形成复合物，再转化为酶和产物。在这个过程中，酶与底物的过渡态互补，亲和力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，使酶促反应大大加速。12、酶比活力：每毫克酶蛋白中所含有的酶活力单位。二、1、简述核酸结构与遗传信息的关系。（1）DNA的一级结构：核苷酸序列、基因组、稀有碱基细菌：基因连续，无内含子，有操纵子，单顺反子。真核：基因断裂，有内含子，有调控基因，多顺反子，重复序列。（2）DNA二级结构：双螺旋、回文结构、三链DNA、H-DNADNA三级结构：超螺旋、负超螺旋DNA四级结构：DNA与蛋白质多复合结构（3）RNA一级结构：稀有碱基、保守序列、甲基化RNA高级结构RNA与蛋白质形成复合物，以RNA-蛋白质复合物执行功能，有时蛋白质起支持作用，而真正起作用的是RNA.2、试述miRNA和siRNA的研究进展。miRNA：一个不断增长的非编码小分子RNA家族，以序列特异性方式（在翻译水平）调控基因的表达。（个人翻译，附英文原文：microRNAsareagrowingfamilyofsmallnoncodingRNAsthatdownregulategeneexpressioninasequencespecificmanner.）siRNA：RNA干涉现象中，介入细胞中特定双链RNA加工裂解成的21-23nt的正义和反义链组成等干扰基因表达的小分子RNA，其引发的RNAi是转录后基因沉默现象的机制之一。3、如何控制核算分子杂交的严谨性。影响核酸分子杂交严谨性的因素有：复性温度、盐浓度、甲酰胺的浓度等，高温、低盐、高浓度甲酰胺有利于高严密性杂交分子的形成。4、确定蛋白质纯化的方法，简述其原理。（1）依据分子大小不同的纯化方法①透析和超滤透析——只用于除盐类和小分子杂质，利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。超滤（ultrafiltration）——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质，利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。②密度梯度离心生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。③凝胶层析(分子筛层析)利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。（2）依据电荷不同的纯化方法电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starchgel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。有：聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析(3)依据溶解度差异分离纯化蛋白质盐溶：低浓度的中性盐可以增加球状蛋白质的溶解度。主要由于蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。盐析：当盐浓度增高时，蛋白质溶解度降低，从水溶中沉淀出来的现象。主要由于大量中性盐的加入，盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化物，导致蛋白质的水合程度减少，从而驱使蛋白质的溶解度降低。蛋白质沉淀剂法：向无细胞抽提液加入沉淀剂，如醋酸铝，丹宁酸或离子型表面活性剂等，可以使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀，沉淀物可以用离心分离除去。5、简述球状蛋白质的三维结构特征。（1）含有多种二元结构原件（2）具有明显的折叠层次（3）在蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是埋藏在分子内部，形成疏水区域；大多数极性侧链总是暴露在分子表面，形成亲水区域。（4）大分子蛋白质常含有几个结构域，结构域划分往往与功能相关。（5）蛋白质分子表面往往有一个内陷的空穴，空穴往往是疏水区，能容纳一个或两个大分子配体的一部分。6、Ks与Kcat的特点？如何应用？Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。Kcat型不可逆抑制剂：这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶共价修饰而失活。应用：对于Ks型不可逆抑制剂，其与底物的结合有专一性，但没有反应的专一性。如果抑制剂与活性中心结合的亲和力大，与活性中心外结合的亲和力小，解离常数相差三个数量级以上，此时可忽略对活性中心外基团的修饰，有较大的应用价值。如亲和标记试剂。（胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。）Kcat型不可逆抑制剂：Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂，在医疗方面起到很大作用。如迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药，单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺），由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。此外对治疗癫痫、肿瘤、震颠麻痹、痛风症等也有很大作用。7、何为蛋白质变性作用？有哪些影响因素？变性后发生的现象？（1）由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生变化，导致生物活性丧失及物理化学性质的异常变化，这一过程称为变性。(2)①温度：温度升高，使分子内振动增强，破坏维系空间结构的次级键的作用（主要是氢键），使蛋白质变性。②酸、碱：主要是由于解离基团质子得失后，生成过多正或负电荷，使肽链间静电斥力增加的结果③有机溶剂A.由于有较低的介电常数，常使肽链内静电斥力增加，造成蛋白质分子膨化或松散；B.在极性较低的有机溶剂环境中，疏水基团易于从内部向外部转移，使疏水作用力削弱，促进蛋白质的变性。④重金属盐在溶液中加入重金属盐类也会影响蛋白质构象的稳定性。重金属盐有可能和蛋白质的极性基团直接作用，使稳定性发生变化，也可能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结构。(3)①生物活性的丧失②侧链基团的暴露③物理化学性质的改变:溶解度.分子形状.粘度等.④化学性质的改变变性后的蛋白质肽链松散，内部侧链基团暴露，易于与有关显色试剂接触，使颜色反应增强。⑤生物化学性质的改变:易被蛋白酶水解.8、Km的意义和作用。是说明两种确定Km的方法并讨论优缺点。(1）物理意义：Km等于酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。(2）Km值愈大，酶与底物的亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。(3）Km值是酶的特征常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件有关，与酶的浓度无关。Km的作用（应用）：1）、利用已知Km和【S】，可根据米氏方程，计算V相对Vmax的%，反之，利用已知Km和V相对Vmax的%，可以根据米氏方程计算【S】。2）、判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。3）、判断在细胞内是否受【S】的调控：【S】远远大于Km，10倍以上，V=Vmax（Km忽略），为零级反应，不受【S】调节；反之，远远小于时，为一级反应，V受【S】调节。4）、判断在细胞中酶催化反应的主要方向：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。5）、推测限速步骤：6）、了解酶的底物在体内具有的浓度水平。求法：(1)Lineweaver-Burk(Double-reciprocal)法特点：最常用,点大多集中在左下方。低[S]的点，倒数后误差大，偏离(2)Hanes-Woolf作图法(3)Eddie-Hofstee作图法(4)Eisenthal和Cornish-Bowden法(5)Scatchard作图法各种方法比较：方法（1）和（4）常用，方法（1）肉眼判断最不可靠。方法（2）和（3）的优点是数点在坐标图中的分布较均匀，v不取倒数，对v误差较大的合适；缺点是X，Y轴包含两个变量。2007年高级生化考试答案一、名词解释1、突变酶:用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶。2、活性中心:酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的活性中心。活性中心必需的基团有：组氨酸的咪唑基、谷氨酸天冬氨酸的侧链羧基和丝氨酸的羟基。3、自杀性底物:自杀性底物，是指那些底物类似物能为酶所催化，其形成产物与酶的活性中心共价结合，不可逆地抑制酶的活性的物质4、蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。5、两可肽：一些肽段形成α－螺旋和β－折叠两种构象的可能性都比较大，而且很接近，对这些既可能形成α－螺旋也可能形成β－折叠的肽段被称为两可肽。6、表观Km值：（没找到）7、SiRNA：小干涉RNA，可作为一种特殊的引物，在RNA指导的RNA聚合酶的作用下，以靶标mRNA为模板合成；后者降解成新的SiRNA，新生成的SiRNA又可进入上述循环。（PCR）8、RNAi：RNA干涉，是由于向细胞内介入特定的双链RNA而引发的一种转录后基因沉默现象9、外遗传:不处于DNA自身核苷酸序列中的，可影响DNA活性的可遗传的性质（影响器官表观型）。10、原位杂交:原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行11、基因芯片：固定有寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA等的生物芯片。利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。二、简答题1、酶、蛋白质分离纯化的原则、方法和原理蛋白质原则：利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状，电离性质，溶解度。吸附性以及生物学功能的专一性等（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)（2）利用溶解度差别分离：（等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）（5）根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）(6)低温有机溶剂沉淀法:用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。酶：（1）根据溶解度差异：盐析、有机溶剂、蛋白质沉淀剂、等电点沉淀、萃取（2）根据分子大小差异：离心、凝胶过滤、透析和超滤（3）根据分子电荷差异：离子交换层析、层析聚焦、电泳、等电聚焦（4）根据没分子专一性结合：亲和层析、亲和超滤、亲和膜、亲和萃取2、反应速度和活化能的关系：根据化学动力学原理，A，B反应物要发生化学反应，二者必须相互碰撞，只有那些具有活化能的反应物分子，在碰撞之后才能发生化学反应。活化能是指从反应物（初态）转化成中间产物（过滤态）所需能量。反应速度与活化分子数有关，反应系数中活化分子数越多，则反应速度越快。活化分子数的多少与活化能高低有关。如果某一反应所需的活化能较大，则活化分子数较少，反应速度较慢，反之，活化能低，活化分子数多，反应就快。3、抑制剂的意义：研究酶的抑制剂及其抑制作用，在工农业生产，医药上，以及基础理论研究上，都具有重要的意义。有不少酶的抑制剂已用于杀虫，灭菌和临床治疗，研究酶的抑制作用，可以为医疗射击有效药物，为农药生产设计新农药，提供理论依据，同时，也为解除抑制剂中毒提出合理的措施。此外，也是研究酶结构与功能的关系、催化机理，以及代谢途径的基本手段4、DNA是高弹度分子脱氧核糖和磷酸组成的骨架上的键可以自由的移动，随着热力学的变化，可使键弯曲、伸展或碱基分开，这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象的这种差异称为多态性。（1）、脱氧核糖的五元环能折叠成各种构象（2）、组成磷酸脱氧核糖骨架的连续的键可以转动（3）、C1-N核糖键可以自由移动5、高严禁分子杂交：分子杂交的严紧程度主要决定于复性温度及溶液中盐与甲酰胺的浓度，强的碱基对能忍受高的温度，高的盐浓度，能使弱的碱基对间的配对稳定，所以高温，低盐浓度，高浓度甲酰胺形成高严禁性杂交分子。6、蛋白质分子量的测定方法:（1）根据化学成分测定分子量。利用化学方法定量测定蛋白质中某一特殊元素或一种氨基酸的百分含量，用下面公式可计算出蛋白质的分子量。分子量=原子量×原子数÷百分含量（2）根据氨基酸残基数估算分子量。对于那些不含辅基的简单蛋白质，若对蛋白质的分子量要求不太精确，又知道蛋白质的氨基酸残基数，可根据氨基酸残基数大体估算蛋白质的分子量。20种氨基酸平均分子量为138，由于组成蛋白质的氨基酸小分子量氨基酸较多，故以128计，又由于肽链中氨基酸之间脱水缩合形成肽键，而每个氨基酸残基的平均分子量可按110估算。（3）SDS法：在含有巯基乙醇（能打开蛋白质二硫键）的SDS（能打开蛋白质的氢键、疏水键）溶液中煮沸蛋白质，SDS结合到蛋白质分子上，并使组成蛋白质的各条链分开。SDS复合物有两个特点：一是SDS大量的负电荷掩盖了蛋白质中的电荷差别，使不同蛋白质所形成的复合物电荷密度都相仿，二是SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，复合物在水溶液中都成雪茄烟形长椭圆棒状，短轴长均为1.5nm，而长轴长度则随蛋白质分子量成正比变化。由于上述两个特征，使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不受蛋白质原有电荷的影响，迁移率成为复合物长度的函数，而长度又与分子量成正比，所以蛋白质-SDS复合物在凝胶中迁移率与蛋白质分子量的关系是：logM=a-b(de/do)其中M为分子量，ab为常数，do为小分子染料迁移距离，de为蛋白质复合物迁移距离。由于logM与de/do成线性关系，用一系列不同分子量的标准蛋白的de/do对logM做图，根据未知蛋白的相对迁移距离，求出位置蛋白质的分子量。（4）聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法蛋白质在具有线性梯度的聚丙烯酰胺梯度凝胶中电泳，使分子朝着凝胶浓度逐渐提高的方向移动，最大的分子最早受到阻挡停止移动，以后随凝胶网格孔径的逐渐变小，较小的分子也依次受阻，分子愈小，走的愈远。相对迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系。梯度凝胶电泳常用4-30％的聚丙烯酰胺梯度凝胶；可以分离分子量50000-2000000的蛋白质。测定是将已知分子量的一系列标准样品同待测样品同时电泳，由于蛋白质分子量的对数与相对迁移率作图呈一条直线，从标准曲线中求出待测样品的分子量。（5）渗透压法（6）超离心沉降速度法（没有详细）7、二硫键的定位原理:（百度上找的，不太确定）样品蛋白质经硫氧还蛋白处理后，利用荧光巯基探针标记巯基，目标蛋白会带上荧光探针。再进行对角线电泳时，如果发现目标蛋白存在分子内二硫键，则经处理后所得的点位于对角线的上方；如果目标蛋白存在分子间二硫键，则经处理后得到的点位于对角线的下方。2006年生化试卷答案1、Abzyme抗体酶通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。2、Uncompetitiveinhibitor：有些抑制剂和底物可同时结合在酶的不同部位上，即抑制剂与酶结合后，不妨碍酶再与底物结合，但所形成的酶—底物—抑制剂三元复合物（ESI）不能发生反应，这种抑制作用叫做Uncompetitiveinhibitor。3、suicidesubstrate又称kact型不可逆抑制剂，不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物，还带有一个潜伏的反应基团，可作用于酶活性部位的必需基团或辅基上，使酶不可逆失活，专一性极高。4、enzymeactivityandspecificactivity:酶的比活力，指每毫克蛋白所含的酶的活力单位数。5、亲和层析：蛋白质分子能对配基专一性地结合成复合物，改变条件，又能分离，利用这种特性而设计的一种层析技术。6、密度梯度区带离心：生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。7、蛋白质完全水解：即将所有的肽键都打断，使蛋白质完全裂解为氨基酸。蛋白质部分水解：即将蛋白质的部分肽键打开，进而部分地分离出所需氨基酸8、DNS-CI-Edman测序法：二甲氨基萘磺酰氯法(DNS法)，亦称丹磺酰氯法Edman法是：①每次被反应和水解的只是N-末端氨基酸残基②与Edman试剂反应的产物为：苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）③PTH-氨基酸可用乙酸乙酯抽提，再用纸层析或薄层层析鉴定9、CDNA文库：由细胞全部MRNA反转录生成的CDNA的克隆总和。10、基因芯片：固定有寡核苷酸、基因组DNA或cDNA等的生物芯片。11、后生遗传：是指不处于DNA自身的核苷酸序列中的可影响DNA活性的任何可遗传的性质（即最终将影响器官的表现型）.有称表遗传，外遗传。12、穿梭载体：通常指那些既能在真核细胞中繁殖也能在原核细胞中繁殖的载体.。二、问答题1、酶的活性部位、特点、研究其方法、原理：与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心，也称为酶的活性部位。通常包括结合中心和催化中心两部分。特点：1）活性部位在酶分子的总体只占有相当小的部分，催化中心一般由2~3个残基组成，结合部位的残基数因酶而异。2）酶的活性部位是一个三维实体；可能是一级结构较远而空间结构较近。3）活性中心构象不是固定不变的。4）活性部位位于酶分子表面的疏水性裂缝中，但也含有极性氨基酸，负责结合与催化。5）底物通过次级键结合到酶上。6）酶的活性部位具有柔性或可运动性。研究技术和原理：1）、X射线衍射法：X射线撞击原子中电子后，产生衍射图，分析结构，把纯酶的射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X射线图谱比较，即可确定酶的活性中心。2）、切除法：对于小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关。3）、酶分子上侧链基团的化学修饰：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。包括非特异性共价修饰和特异性共价修饰。4）、差示标记法：利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析出去保护剂，再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中心。5)、动力学分析法：改变PH，通过参数Vmax或Km与PH关系试验，可以提供与反应有关解离基团的pK值，可知哪个氨基酸与酶活性有关。6）、亲和标记：根据酶和底物的特异性结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能像底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。7）、定位诱变法：直接修饰基因片段或个别密码子，有目的的改变氨基酸残基，与野生型酶对比，判断被诱变残基在结合底物、催化底物反应中的作用。2、酶的km值与ks值有什么不同，试说明二种确定km值的方法并讨论优缺点。（没有找到确切答案）酶的km值是它是当酶反应速率达到最大速度一半时的底物浓度。（1）Km是酶的一个特征常数，可用来鉴别酶。(2)km值可以判断酶的专一性和天然底物。最适底物时酶的亲和力最大，km最小。Ks值v-【s】的动力学曲线不是双曲线而是s型曲线或表观曲线，两者均不符合米氏方程。Km值可通过实验数据通过作图法直接求的。其中最重要的是双倒数作图法。一下为老师课件上的答案：（1）Lineweaver-Burk(Double-reciprocal)法(2)Hanes-Woolf作图法(3)Eddie-Hofstee作图法(4)Eisenthal和Cornish-Bowden各种方法比较：?方法（1）和（4）常用，方法（1）肉眼判断最不可靠。?方法（2）和（3）的优点是数点在坐标图中的分布较均匀，v不取倒数，对v误差较大的合适；缺点是X，Y轴包含两个变量。3、ks型专一不可逆抑制剂有哪些特征？有何应用?专一不可逆抑制作用：抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其他必须基团，进行了共价结合，从而抑制酶的活性。Ks型抑制剂的特点：（1）与底物S结构类似（2）有活泼基团胰凝乳蛋白酶——TPCK胰蛋白酶————TLCK丙酮酸羧化酶——溴代丙酮酸：（E—SH）4、使蛋白沉淀的方法有哪些？简述各种方法的原理。1）、盐析法：中性盐对球状蛋白质的溶解度可能产生两种影响，低浓度时可增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。当盐浓度增大时，如饱和或不饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析的而主要作用是由于大量的中性盐的加入，盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度的减少，从而使蛋白质溶解度降低。2）、有机溶剂法：有机溶剂中有较低的介电常数，根据库伦定律，介电常数降低，将增加两个相反电荷之间的吸引力。在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在，这时如果添加有机溶剂，使蛋白质溶液的介电常数减小，增强偶极离子间的静电引力，从而使蛋白质分子聚合而沉淀。有机溶剂自身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也使蛋白质分子变得不稳定而沉淀出来。3）、蛋白质沉淀剂法：向蛋白质水溶液中加入沉淀剂，使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀，这些沉淀物可以通过离心分离而除去。4）、等电点沉淀：不同的蛋白质有不同的等电点，利用不同蛋白质等电点的差异，调节溶液pH等于所需蛋白质的等电点，则所需蛋白质结絮沉淀。5、试述蛋白质一级结构测定中将二硫键定位的方法，并简述其原理。1）.用胃蛋白酶水解原来的含-S-S-的蛋白质(链内、链间)成较小的肽段。2）.所得肽段混合物用对角线电泳技术进行分离含-S-S-的肽段。3）.将滤纸暴露在过甲酸蒸气中，供-S-S-断裂，被氧化成含两个半胱氨磺酸的肽段。4）.将滤纸旋转90°，进行第二向电泳，由于含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含—S—S—的肽段小，且负电荷增加，都偏离对角线。5）.将每对含半胱氨磺酸的肽段分别取下，测序，与多肽链的氨基酸顺序比较，推断—S—S在肽链间或肽链内位置6、为什么说DNA是有高度弹性的分子？脱氧核糖和磷酸组成的骨架上的许多键都可以转动，随热力学的变化，可以使链弯曲、延伸、或碱基分开。这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象上这种差异称为多态性。细胞存在于watson和crick所描述的DNA双螺旋结构有显著的差异的DNA结构。A型和Z型的DNA。在一定的条件下，B-DNA可以转变成A-DNA或Z-DNA。通常这些变化并不影响watson和crick所定义的DNA双螺旋的关键特征：链间互补，反向平行，A=T,与C与G.。DNA结构变异反应在三个反面:(1)脱氧核糖的五元环能折叠成多种构象；(2)组成磷酸脱氧核糖骨架的连续的键可以转动。(3)CI-N糖苷键可以自由的转动。7、简述Sanger双脱氧链末端终止法测序的基本原理。Sanger酶法双脱氧链末端终止法：利用噬菌体r13在生活周期上的特点，使用DNA重组技术，建立了通用模板和通用引物的快速检测方法。原理及方法：①分别进行4组反应，每组反应中含有4dNTP及其中的一种ddNTP。②通过控制反应系统中dNTP与ddNTP的比例，可以是双脱氧核苷酸随机的参入互补链并在不同的位置上终止合成反应。最后得到一组长短不同，而3’末端均以双脱氧核苷酸结尾的DNA片段。4组反应就得到4组片段，而5’端一律从引物开始有相同起点带放射性标记。③在高分辨率的聚丙酰变性凝胶上电泳分离，可以按片段从小到大的顺序读出氨基酸顺序。8、有人说“it’sasmallRNAworld,afterall”,对此有何理解？1、mRNA:编码蛋白质的转录产物，携带翻译信息。2、tRNA:翻译过程中的适配器，将mRNA的三联体密码子翻译成蛋白质的序列，在反转录病毒中tRNA可以作为DNA的引物。3、rRNA：核糖体的骨架构成，翻译机制的中心，催化肽链的形成。4、hnRNA：mRNA剪接前体，真核生物基因转录产物经加工形成大小不等的中间产物。5、snRNA：核质中低分子量的RNA，参与mRNA、tRNA、rRNA前体的加工，协调胞内物质运输，参与分泌蛋白的运输，代谢稳定进化上保守，有些5’端有帽子结构与蛋白质连在一起以核糖核蛋白RNP形式存在。6、siRNA：RNA干涉现象中，中介入细胞中特定双链RNA加工裂解成的21-23nt的正义和反义链组成等干扰基因表达的小分子RNA，其引发的RNAi是转录后基因沉默现象的机制之一。7、micRNA（反义RNA）：与mRNA互补，可与其形成双螺旋结构阻断蛋白质的合成，在翻译水平上调节G的表达。8、ribozyme:具有高效特异催化功能的RNA。9、脱氧核酶：具有催化活性的单链RNA分子，具有ASODN的反义抑制作用和核酶的靶向性剪切活性，稳定性好。10、ASODN（反义寡聚脱氧核糖核酸）：人工合成的，与靶mRNA配对互补，以激活Rnaseh来降解RNA／DNA杂交分子中的靶RNA，阻止RNA的加工、翻译、抑制G的表达。11、iRNA：在DNA复制过程中作为后滞链合成引物的短RNA片段。12、端粒RNA：端粒酶的组成部分，可作为形成端粒重复序列的模板。13、sncRNA（核仁小RNA）：核仁中RNA加工与碱基修饰所必需的。14、scRNA(胞质内小RNA)：在胞质中发现的多种功能的低分子量RNA。《高级生物化学》试卷（A卷）2004.6一、名词解释ribozyme：核酶，具有生物催化活性的核酸。activesite：活性中心，在酶蛋白上，只有少数一些特异的氨基酸残基才和催化能力直接相关，这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力显示有关的区域，称为活性中心。suicidesubstrate：①具有天然S的类似结构②本身也是酶的Si，可被酶催化③具有潜伏性反应基团，可因酶的催化而暴露or活化，并作用于酶的活性中心。即Si经催化后才能形成酶的不可逆I。allostericenzymeorallostericinhibitor：变构酶，发生别位效应的酶。变构抑制剂，不作用于活性中心，而是活性中心以外的部位，引起分子构象变化，来调节酶活力。DNS-Cl-Edman测序法：将高灵敏度的DNS-Cl技术与能连续降解的Edman反应相结合，逐一检测N-端aa的方法。4.416螺旋：为非整数螺旋，n=4，不稳定，仅在过氧化氢酶中发现。4.416螺旋也称π螺旋，多为右手螺旋，其结构与α螺旋类似，只是π螺旋是由肽链骨架上n位氨基酸残基的－C＝O与n+5位残基的－NH－之间形成氢键形成，氢键环有16个原子，每圈有4.4个氨基酸残基，而且每个氨基酸残基环绕螺旋轴87°，沿轴上升0.115nm。π螺旋的二面角（φ,ψ）一般在（?55°,?70°）左右。（红色标注的为课件上介绍，黑色为网络上答案）卫星DNA与卫星RNA：主要分布在染色体着丝粒部位，又非常短的串联多次重复DNA序列组成，因其低复杂性，又因其不同寻常的核苷酸组成，经常在浮力密度梯度离中心从整个基因组DNA中分离成一个或多个“卫星”条带，故称为卫星DNA。与辅助病毒RNA存在于同一病毒颗粒中的小分子RNA，与卫星病毒不同之处在于它们不具备为外壳蛋白编码的能力，所以与辅助病毒的RNA包装在一起，抗原性相同Southern印迹杂交：将凝胶上分离的DNA片断转移到硝酸纤维素膜上，再通过同位素标记的单链DNA或DNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段的方法。二、简答题1、为什么酶具有很高的催化效率？催化本质——降低反应的活化能（1）邻近效应和定位效应：E对S的分子轨道导向作用；催化基团与被催化基团处于最临近位置，发生分子内反应；对S的固定作用，延长ES平均寿命，增大产物生成几率。（2）扭曲变形和构象变化：扭曲的能量释放，加速反应；酶构象改变，从低活性到高活性，S在酶诱导下，键扭曲，变形和去稳定作用，S构象更像过渡态。（3）广义的酸碱催化：催化基团——质子供体or质子受体。（4）金属离子催化：相当于酸催化，可带多电荷；络合作用；可维持较高浓度。（5）共价催化（亲和亲电催化）：亲核剂：电子供体；亲电剂：电子受体。（6）微环境的影响：活性中心往往处于疏水口袋或裂缝中，在位于疏水环境中时，介电常数低，利于中间物的生成和稳定，从而利于反应。2、Ks型专一不可逆抑制剂有哪些特征？如何应用？特征：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。应用：对于Ks型不可逆抑制剂，其与底物的结合有专一性，但没有反应的专一性。如果抑制剂与活性中心结合的亲和力大，与活性中心外结合的亲和力小，解离常数相差三个数量级以上，此时可忽略对活性中心外基团的修饰，有较大的应用价值。如亲和标记试剂。（胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。）3、根据分子大小不同分离纯化蛋白质的方法有哪些？试举出三种方法简述其原理。①透析：利用蛋白质大分子不能透过半透膜而小分子杂质能透过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开。②超过滤：对一种型号的超滤膜来说，比分子量截止值小的蛋白质分子能透过膜孔，比分子量截至值大的蛋白质分子不能透过膜孔，而被截住。③密度梯度区带离心分离法：在离心力的作用下，不同蛋白质分子的沉降速度与分子大小和密度有关，从而在离心管中形成若干条区带。④凝